比色法测定原料肉新鲜度方法的建立

胡亚云，李志成，，*，梁 娜，岳田利，白连社，李 猛，黄雪隔

（1.西北农林科技大学食品科学博士后流动站，陕西杨凌712100；2.合肥美菱股份有限公司博士后工作站，安徽合肥230601）

比色法测定原料肉新鲜度方法的建立

胡亚云1，李志成1，2，*，梁 娜1，岳田利1，白连社2，李 猛2，黄雪隔1

（1.西北农林科技大学食品科学博士后流动站，陕西杨凌712100；2.合肥美菱股份有限公司博士后工作站，安徽合肥230601）

总挥发性盐基氮（TVB-N）值是国家标准中用于评价肉质鲜度的唯一理化指标。以对二甲氨基苯甲醛（PDAB）为显色剂，研究原料肉中TVB-N含量与吸光度的关系。结果表明，1mL的肉浸汁中加入1.8%（W/V）PDAB显色剂4.5mL，浓盐酸1.2mL，蒸馏水3.3mL，于80℃水浴中加热8min，在446nm处测定其吸光度，一定范围内吸光度与TVB-N的含量成线性关系，因此建立了比色法测定原料肉新鲜度的方法。利用PDAB比色法检测原料肉的新鲜度，具有较高的精确度和回收率，而且快速、稳定、操作简单，可作为国家标准中测定原料肉新鲜度的替代方法之一。

原料肉，总挥发性盐基氮，对二甲氨基苯甲醛，比色，方法

肉类产业是农业的重要组成部分，肉类工程是重要的菜篮子工程，与人民的生活息息相关。随着人们生活质量的提高，消费者对肉的品质卫生要求不断提高，如何准确、快速地评定肉品的新鲜度不但是肉类企业和政府质量安全监管人员的迫切需求，也关系着广大消费者的身体健康[1]。目前我国对肉品新鲜度的评定主要采用感官指标（色泽、黏度、弹性、气味等）与理化标准相结合的方法[2-4]。感官方法主观性强，不易量化；理化指标中pH和水分的测定[5-6]不能确定肉品的新鲜度，只有总挥发性盐基氮（TVB-N）的测定是国标现行检测方法[7-8]。国标定量方法中的半微量定氮法和微量扩散法[9-10]都存在操作要求条件高，费时费力，尤其最常用的半微量定氮法，蒸馏时间的长短、蒸汽通入量的大小、反应的强弱、反应终点的判定均对测定结果产生较大影响，不能达到快速、准确检测的目的，而且误差较大[8，11]。国内外也有用近红外法和比色法测定TVB-N的报道[12-14]，但近红外法设备投入较高，比色法氯化对硝基重氮苯法[11]试剂配制较困难，且测定结果误差较大，乙酰丙酮-甲醛法测定前要煮沸15m in，条件剧烈，总体测定时间较长，最主要的是这两种比色方法并没有建立起吸光度与肉浸汁挥发性盐基氮之间的关系式，现实中无法应用。

本实验参照尿素的测定方法[15]，以对二甲氨基苯甲醛（PDAB）为显色剂，研究原料肉中TVB-N值与吸光度的关系，探索比色法测定原料肉新鲜度的方法，为市场提供快速、准确、批量检测原料肉新鲜度的新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

猪肉 购于杨凌农贸市场，浓盐酸、无水硫酸钠、氧化镁、硼酸、无水乙醇、甲基橙、亚甲基蓝、甲基红、对二甲氨基苯甲醛（PDAB） 均为国产分析纯。

UV-1700双光束紫外光分光光度计、UV-1240双光束紫外光分光光度计 日本岛津；ESJ60-4电子天平 0.0001g，上海九顶称重设备系统有限公司；SB-5200T超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司；101-AB电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品肉预处理 取3个不同新鲜度的切碎、混匀的猪肉样品，1号新鲜猪肉，2号为1号常温放置48h的不新鲜猪肉，稍有腐败气味，3号为1号常温放置7d的腐败猪肉，各30.00g，分别放入盛有300m L无氨蒸馏水中的三角瓶中（下同）400r/min振荡浸提5min，滤纸过滤，滤液加签标号1、2、3，置于4℃和-20℃待用。1.2.2 挥发性盐基氮（TVB-N）含量的测定 按照国标GB/T 5009.44-2003执行[8]。实际测定1、2、3号猪肉样品的TVB-N值分别为5.76、15.17、41.13mg/100g。其中2号肉浸汁设为标准肉浸汁。

1.2.3 PDAB比色法最大吸收波长的确定 取2个10m L的容量瓶，于样品瓶中依次加入1m L标准肉浸汁，4m L PDAB显色剂，2m L浓盐酸，用蒸馏水定容到10m L，空白瓶用1m L蒸馏水取代样品瓶中的肉浸汁，用1.0cm比色皿比色，用蒸馏水调零，然后在波长440～460nm，间隔2nm，测定样品瓶和空白瓶的吸光度。

1.2.4 显色剂浓度的确定 准确称取5.00g PDAB粉末于小烧杯中，先用少量无水乙醇溶解，再转入25m L容量瓶中，用无水乙醇定容，配制成浓度为20%的显色剂。精密移取20%的显色剂0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5m L置于8个10m L容量瓶中，用无水乙醇定容，配制成浓度分别为1.6%、1.8%、2.0%、2.2%、2.4%、2.6%、2.8%、3.0%的显色剂，浓度由低到高加签标示1～8号。

取16个10m L的容量瓶，加签标示样品瓶1～8号和空白瓶9～16号，在样品瓶中均加入1.0m L标准肉浸汁，在空白瓶中均加入1.0m L的蒸馏水，然后按1～8的编号次序对应加入样品瓶1～8号和空白瓶9～16号已配制好的不同浓度的显色剂各4m L、浓盐酸各2m L，最后用蒸馏水定容，配制成不同PDAB用量梯度的样品比色液和空白比色液。使用1cm比色皿，于波长440～460nm，间隔2nm，测定样品瓶和空白瓶的吸光度。

1.2.5 显色剂用量的确定 取10个10m L的容量瓶，分别加入1m L肉浸汁，再依次加入配制好的显色剂1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00、5.50、 6.00m L，加入2m L浓盐酸，蒸馏水定容。然后在波长446nm处测得吸光度，同时用蒸馏水代替肉浸汁分别做空白对照。

1.2.6 浓盐酸用量的确定 取9个10m L的容量瓶，分别加入1m L肉浸汁，再各加入4.5m L配制好的显色剂。然后往1～9号试管中依次加入0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80m L浓盐酸，蒸馏水定容，在波长446nm处测得吸光度。同时用蒸馏水代替肉浸汁分别做空白对照，记录数据。

1.2.7 显色时间和稳定性的确定 取1m L标准肉浸汁于10m L容量瓶中，加入4.5m L显色剂，1.2m L浓盐酸，蒸馏水定容，80℃水浴加热2、3、4、5、6、7、8、9、10m in，冷却后分别于室温下放置15、30、45、60m in，测定其在446nm处的吸光度，同时用蒸馏水代替肉浸汁做空白实验，确定反应时间及样液的稳定时间。

1.2.8 标准曲线绘制 取8个10m L的容量瓶，分别加入标准肉浸汁（TVB-N值15.17mg/100g）0.00、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.5m L（分别相当于0.00、0.30、0.91、1.52、2.12、2.73、3.33、3.79mg/100g的挥发性盐基氮，国标蒸馏法测得），再各加入4.5m L配制好的显色剂，然后各自缓慢加入浓盐酸溶液1.2m L，蒸馏水定容到10m L，最后在80℃水浴加热8m in，冷却至室温后在446nm处测定吸光度，以第一管做空白对照，以挥发性盐基氮含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.9 精密度实验 取肉浸汁10m L，用国标蒸馏法测得其挥发性盐基氮含量为11.85mg/100g，按2.2制作标准曲线的条件和方法，测定吸光度，做6个平行，根据标准曲线方程计算对应的挥发性盐基氮的含量，计算相对标准偏差。

1.2.10 加标回收率及准确度实验 取已知TVB-N含量分别为11.85mg/100g和25.78mg/100g肉浸汁各50m L（相当于5g猪肉），分别加入TVB-N含量为15.17mg/100g肉浸汁50m L，混匀，其TVB-N含量分别为13.51mg/100g和20.48mg/100g，分别取1m L加标混合肉浸汁于10m L容量瓶中，按标准曲线制作的条件和方法测定各自的吸光度，同时用等量蒸馏水代替肉浸汁做空白对照，然后依据标准曲线方程计算对应的挥发性盐基氮的含量，并分别与实际浓度作比较，平行测定6次。计算加标回收率及相对误差。

加标回收率（%）=测定浓度（mg/100g）/实际浓度（mg/100g）×100

1.2.11 实际样品的测定 取A、B、C三个未知新鲜度的猪肉浸汁滤液，分别按照本文建立的比色法和国标蒸馏法测定其挥发性盐基氮含量，计算其相对误差。

1.2.12 数据处理 所有实验均做3个以上平行，采用DPS 7.55和Excel进行数据处理、制作图表。所得结果多以均值±标准差的形式表示。

2 结果与分析

2.1 PDAB比色条件的确定

2.1.1 PDAB比色法吸收波长的确定 由图1可以看出在波长为446nm时，样品吸光度与空白吸光度的差值最大。按照在试剂空白影响尽量低的情况下，尽可能选择较大样品吸光值的原则，PDAB比色法的最佳波长应该为446nm。因此，选择446nm作为PDAB比色法测定TVB-N的最佳波长。

图1 最佳波长的确定Fig.1 The choice of optimalwavelengths

2.1.2 显色剂浓度的确定 由图2可知，当显色剂浓度为1.8%时，样品吸光度与空白吸光度的差值最大，按照在试剂空白影响尽量低的情况下，尽可能选择较大样品吸光值的原则，选择PDAB显色剂最佳浓度为1.8%（W/V）。

图2 显色剂浓度的确定Fig.2 The concentration choice of chromogenic reagent

2.1.3 显色剂用量的确定 由图3可知，在肉浸汁和浓盐酸用量不变的情况下，随着PDAB显色剂用量（1.8%，W/V）的增加，在相当宽的范围内，样品吸光度几乎呈线形增加。当加入4.5m L显色剂时，吸光度达到最大，继续加大显色剂用量，变化幅度很小。因此选择PDAB显色剂最佳用量为4.5m L。

图3 显色剂用量对样品吸光度的影响Fig.3 The effectofaddition of chromogenic agenton absorbance

2.1.4 浓盐酸用量的确定 由图4可知，在样品液和显色剂加入量一致的情况下，随着溶液酸度的增加，溶液吸光度增大，当浓盐酸的加入量达到1.2m L时，溶液吸光度最大，继续增大盐酸用量，吸光度下降且会产生白色沉淀。因此，浓盐酸的适宜加入量为1.2m L。

图4 盐酸用量对吸光度的影响Fig.4 The effectof addition of HCl on absorbance

2.1.5 显色时间和稳定性的确定 由图5可知，反应时间2～7m in时吸光值几乎呈直线下降，7m in时趋于稳定，8～60min吸光度均很稳定，因此适合的显色时间为8m in，稳定时间可达60m in。

图5 显色和稳定时间的对吸光度的影响Fig.5 The effectof chromogenic and setting time on absorbance

2.2 标准曲线绘制

由图6可知，挥发性盐基氮含量与吸光度成良好线性关系，线性方程为：y=9.2979x+0.2123，R2= 0.9915。

图6 吸光度与挥发性盐基氮含量关系Fig.6 The standard curvewhich shows the relationship between the absorbance and TVB-N content

样液TVB-N含量在0.2～4.0mg/100g均保持良好的线性关系。由于样品测定时稀释了10倍，因此，样品的TVB-N含量y=10×（9.2979x+0.2123）。

按照分光光度法的要求，以吸光度为0.002时的浓度为极限，实验得出挥发性盐基氮含量最低检测限为2.31mg/100g。不同批次的原料肉最好用该批原料肉做标准肉浸汁建立吸光度与TVB-N之间的标准曲线方程，这样误差较小。

2.3 精密度实验

猪肉样品（TVB-N=11.85mg/100g）平行测定6次的结果，不论是以吸光度还是换算为TVB-N的值，其相对标准偏差（RSD）均小于5%（表1），说明比色法测定猪肉挥发性盐基氮的方法精密度高，可靠性好，是测定肉品新鲜度的好方法。

表1 比色法测定挥发性盐基氮的相对标准偏差Table 1 The relative standard deviation of colorimetric determination of TVB-N

2.4 准确度实验

准确度是测定值或测定平均值与真值之间的接近程度，用误差或相对误差来表征。从表2可以看出，样品总相对误差小于5%，说明用比色法测定原料肉的TVB-N结果准确度较高。从表2还可以看出，样品加标回收率在94.50%～104.91%之间，辅助说明测定结果准确，测定方法可行。

2.5 实际样品的测定与验证

按照本文建立的方法测定3个未知猪肉样品A、B、C的吸光值，由标准曲线方程y=10×（9.2979x+0.2123），R2=0.9915计算3个样品液中挥发性盐基氮含量。再按国标蒸馏法测定该3个样品的挥发性盐基氮含量，测得结果见表3。由表3得知，与用蒸馏法测定的结果相比较，比色法测定TVB-N的值的相对误差小于5%，标准偏差远小于蒸馏法。而国标蒸馏法要经过蒸馏装置安装，通蒸汽蒸馏、馏分收集、配制混合指示剂、滴定等繁琐步骤，单独测定一个样品需要1h以上，而且测定结果误差较大。因此，用比色法测定肉中挥发性盐基氮的含量准确度高、方便、省时，每个样总共需不到30m in，批量检测所需时间更少，可用于原料肉新鲜度的快速测定，可以作为国标蒸馏法的替代方法之一。

表3 三个猪肉样品TVB-N含量的测定与验证Table 3 Determination and verification of TVB-N of three beef samples

3 结论

建立了比色法测定原料肉新鲜度的方法。1m L的肉浸汁中加入1.8%（W/V）PDAB显色剂4.5m L，浓盐酸1.2m L，蒸馏水补足至10m L，于80℃水浴中加热8m in，在446nm处测定其吸光度，吸光度与TVB-N的含量在一定范围成线性关系。利用PDAB比色法检测原料肉的新鲜度，具有较高的精确度和准确度，而且快速、稳定、操作简单，可以作为国家标准中测定原料肉新鲜度的替代方法之一。

本文虽然以猪肉为样品，建立了比色法测定原料肉新鲜度的方法，以同样的方法还成功建立了比色测定牛肉新鲜度的方法，推断以所测定畜禽肉种类的肉浸汁为标准肉浸汁能够测定该畜禽肉的新鲜度，但实际是否全部适合还要进一步的实验。另外，肉浸汁振荡浸提、标准液的制备、标准，肉浸汁标准品的具体成分、含量、比例，不同种类畜禽、水产原料的新鲜度的标准品是否可以共用等等，还需要进一步的研究。

表2 比色法测定挥发性盐基氮的回收率Table 2 The recovery rate of colorimetric determination of TVB-N

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Establishment of colorimetric determ ination method of raw meat freshness

HU Ya-yun1，LIZhi-cheng1，2，*，LIANG Na1，YUE Tian-li1，BAILian-she2，LIMeng2，HUANG Xue-ge1
（1.The Postdoctoral Station of Food Science，Northwest A&FUniversity，Yangling 712100，China；2.The PostdoctoralWorking Station，HefeiMeiling Co.，Ltd.，Hefei230601，China）

Total volatile basic nitrogen（TVB-N）was the unique physicaland chem ical indicators to evaluate the freshness of meat in the national standard.The p-d imethylam inobenzaldehyde（PDAB）being chromogenic reagent，the relationship between the TVB-N contentand its absorbance was studied.Colorimetric determ ination method of raw meat freshness was estab lished.The results showed that 1m L of extraction from raw meatwas added 1.8%（W/V）PDAB chromogenic agent 4.5m L，and concentrated hyd rochloric acid 1.2m L，and distilled water 3.3m L，and heated for eightm inutes in a water bath at 80℃.The relationship between the absorbance which was measured at 446nm and TVB-N content of raw meat was linear.The method of colorimetric determ ination of raw meat freshness by PDAB was estab lished，which was fast，stab le，and easy to operate and w ith high p recision and recovery.This m ight be one of the alternative formeasuring freshness of raw meat in future nationalstandards.

raw meat；totalvolatile basic nitrogen（TVB-N）；p-dimethylam inobenzaldehyde（PDAB）；colorimetric；method

TS251.7

A

1002-0306（2014）18-0059-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.003

2013－12－06 *通讯联系人

胡亚云（1974-），女，硕士研究生，实验师，主要从事农产品加工方面的研究。

陕西省科技统筹创新工程计划项目（2011KTCL02-07）；合肥美菱股份有限公司博士后项目（201207031）。