用多重PCR方法检测奶牛场麻雀中分枝杆菌感染情况

，，，，

（1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832000；2.新疆生产建设兵团第十二师畜牧兽医工作站，新疆乌鲁木齐 830000；3. 新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总站，新疆乌鲁木齐 830000）

用多重PCR方法检测奶牛场麻雀中分枝杆菌感染情况

周方永1，蒋业慧1，梁俊明2，李 岩3，马 勋1

（1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子832000；2.新疆生产建设兵团第十二师畜牧兽医工作站，新疆乌鲁木齐830000；3. 新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总站，新疆乌鲁木齐830000）

目的利用可以鉴别分支杆菌属中结核分枝杆菌、牛分支杆菌、非结核分枝杆菌多重PCR方法，检测奶牛场麻雀组织中分支杆菌感染情况。方法根据结核分枝杆菌种特异基因目的片段MTP40、分枝杆菌属特异基因32kD、结核分枝杆菌复合群特异基因IS6110插入序列，设计合成三对特异性引物，扩增对32kD的506bp、MTP40的396bp和IS6110的984bp片段，以此方法检测奶牛场麻雀肺组织中分支杆菌感染情况，并对阳性结果的目的片段进行克隆测序。结果在分析的21份麻雀肺组织中，检测出2例非结核分枝杆菌阳性病料，阳性率9.52%。2例阳性样本PCR扩增得到的片段与GenBank收录的32kD基因同源性分别为95.8%和97.2%。结论麻雀肺组织中存在分支杆菌感染阳性病例提示该牛场中生物体内存在分支杆菌潜伏感染，并可能导致奶牛的潜伏感染以及干扰结核检疫。

奶牛场；分枝杆菌；麻雀；多重PCR

目前国内外牛结核的检疫方法主要是皮内变态反应试验，检疫所应用的诊断试剂PPD是多种抗原的混合物，所含的抗原为致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌及BCG所共有，由于交叉反应的存在，其非特异性检出在所难免[1]。有研究表明，接触“环境”分枝杆菌对此后接触致病性分枝杆菌时的免疫应答性质有明显作用[2]，出现结核检疫的皮试假阳性的原因与牛、养殖场周围的生物以及环境中其他结核杆菌及非结核杆菌的携带情况有关。

分枝杆菌广泛分布于环境之中，可从土壤、水、植物和粪便中分离到。奶牛养殖场周围的分枝杆菌的分布与周围的生物以及环境中细菌的携带情况有关。鸡最易感染，鸭、鹅和鸽等都能感染，其他鸟类也有携带并感染的报道，主要通过含病菌的粪便及分泌物污染土壤、垫草、用具、饲料和饮水，健康牛吞食后而受感染。鸡蛋、野禽（孔雀、麻雀、燕子、雉、乌鸦、猫头鹰等）也能传播分枝杆菌[3]。了解奶牛场周围生物分枝杆菌的携带情况对防控奶牛分枝杆菌感染和分枝杆菌溯源具有重要意义。

1 材料

1.1标 准菌种 结核分枝 杆菌H37Ra国际标准无毒株、卡介苗（BCG）取自石河子大学医学院病原室；龟分枝杆菌（MC）、大肠杆菌（DH5α）为本实验室菌种库保存； 禽分枝杆菌（MAP）、胞内分枝杆菌（MAC）、偶发分枝杆菌（MF）、耻垢分枝杆菌（MS）由华中农业大学郭爱珍教授惠赠。

1.2主要试剂与材料 Marker 2000bpDNA ladders、TaqDNA 聚合酶购自东盛公司；DNA胶回收试剂盒、组织总DNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒、PMD-19-T载体（TIANGEN公司）；PCR引物由北京华大基因合成；改良罗氏培养基、苏通液体培养基。

1.3临床标本的来源 麻雀21只，于奶牛养殖场结核检疫过程中抓捕所得，封袋分装，详细标记，送至实验室-20℃保存。

1.4引物设计与合成：

根据GenBank中登录的结核分枝杆菌种特异基因目的片段MTP40（结核分枝杆菌种特异基因）、32kD（分枝杆菌属特异基因）、IS6110插入序列（结核分枝杆菌复合群特异基因）[4]，设计合成三对特异性引物PT1，PT2；MT1，MT2；IS5，IS6（表1）。

表1引物设计

2 方法

2.1细菌标准株的培养

将禽结核杆菌、胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、龟分枝杆菌接种至改良罗氏培养基，37℃培养箱中培养培养。禽分枝杆菌、胞内分枝杆菌属缓慢生长菌，培养周期4周左右可用于实验；龟分枝杆菌、偶发分枝杆菌、耻垢分枝杆菌属快速生长菌，培养24h即可用于实验[5]。大肠杆菌接种于 LB液体培养基中，180r/min，37℃恒温培养24h。

2.2模板的制备：

2.2.1细菌标准株模板的提取

采用水煮法制备细菌DNA模板，具体过程参见沈德新等[6]关于细菌DNA的提取方法。

2.2.2麻雀肺脏组织DNA的提取

2.2.2.1样品前处理

解剖麻雀，无菌取肺脏组织，用手术剪将组织剪碎后，于匀浆器中研磨组织至液化。组织悬液用4倍体积4%NaOH作用15min左右，除掉杂菌；再用HCl中和，12000r/min离心5min，弃上清液，向沉淀中加入无菌ddH2O，再次离心弃上清，收集沉淀备后期试验用。

2.2.2.2肺组织DNA的提取

参照组织、血液、细胞DNA提取试剂盒说明书进行。

2.3多重PCR反应及检测

PCR反应体系为25μL的 PCR 反应体系：Taq酶 0.5μL、10*PCR buffer 2μL、10mM DNTPs 2μL、模板DNA 2μL、上下游引物各1μL，加水至25μL。阴性对照以大肠杆菌代替模板。PCR反应程序为： 95℃预变性5min； 94℃变性1min，65℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。

反应结束，分别取5μLPCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

2.4多重PCR特异性试验

利用建立的多重PCR同时对结核分枝杆菌H37Ra、卡介苗、禽分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、龟分枝杆菌和阴性对照菌株大肠杆菌（DH5α）进行扩增，确定方法的特异性。

2.5多重PCR敏感性试验

将提取的结核分枝杆菌H37Ra总DNA，用核酸测定仪确定其浓度为3.3ng/μL，然后从3.3 ng开始按10倍递增稀释至10-6，各取2μL，进行多重进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳观察电泳图谱，确定方法的敏感性。

2.6多重PCR方法的临床检测

利用建立的分枝杆菌多重PCR方法扩增麻雀肺组织DNA中的目的基因片段，并通过琼脂糖凝胶电泳、成像观察扩增结果。

2.7目的基因片段的克隆测序

2.7.1目的基因的回收

利用天根公司胶回收试剂盒回收目的基因，具体步骤参见试剂盒说明书。

2.7.2目的基因与载体连接：

按pMDTM19-T戴体说明书进行（表2），向体系中加入Solution I 5μL（等量），16℃过夜反应。

表2连接体系

2.7.3连接产物的转化

将-80℃冻存的感受态细胞取出置冰上融化后，吸取100μL于1.5mL无菌EP管内，加入连接产物（约5～10μL）混匀，冰浴30min，42℃水浴热击90s（热激），再置冰上2min（冷激），加入400μL LB液体培养基，37℃200r/min摇床振荡培养45min。离心后留100μL培养液，用滴头吹打使菌体悬浮，将菌液涂于AMP平板，37℃培养过夜，观察转化结果。

2.7.4AMP抗性筛选

挑取AMP抗性培养基中的单菌落，转接入空白的AMP抗性平板，为了增加阳性筛选率，尽可能多挑取单菌落数，分别标记完整，密封。置温箱内37℃培养24h。

2.7.5菌液PCR鉴定

滴头挑取少量扩大培养的阳性转化子入PCR管中，以菌液为模板进行PCR扩增，鉴定阳性转化子。

2.7.6阳性转化子的质粒抽提

采用天根UNIQ-10 柱式质粒抽提试剂盒进行提取，送六合华大基因公司测序。

3 结果与分析

3.1多重PCR的特异性试验

结核分枝杆菌、卡介苗、龟分枝杆菌、禽分枝杆菌、偶发分枝杆菌、胞内分枝杆菌、耻垢分枝杆菌均能扩增出各自的目的条带，大肠杆菌未扩增出特异性条带（图1）。

图1 引物特异性试验结果

3.2多重PCR敏感性试验 在25μL体系中， 3对引物的终浓度均为0.2μmol/L，多重PCR敏感性为10-6ng（图2）。

3.3麻雀组织中分枝杆菌多重PCR反应检测结果

对经过前处理的麻雀肺脏组织总DNA进行多重PCR检测，检测结果显示，在21份肺组织样品中，未检测出牛分枝杆菌和结核分枝杆菌感染者，有2（泳道4和12）份呈非结核分枝杆菌阳性（图3），检出率为9.52%。

3.4扩增片段的克隆测序结果

将目的基因的测序结果进行Blast对比，结果表明所得到的片段与GenBank收录的32kD基因同源性分别为95.8%和97.2%。

图2多重PCR敏感性试验结果

图3多重PCR反应麻雀检测结果

4 讨论

非结核分枝杆菌（Nontuberculous Mycobacterium，NTM）广泛存在于自然环境中，土壤、水源、草皮、粪便、动植物表面等都可以分离到NTM[7]，在我们日常饮用的牛奶、自来水中也有分离到NTM的报道[8-9]，在1988年和1997年美国就曾经报道从321份生活用水中分离出80株戈登分枝杆菌和47株鸟分枝杆菌[10-11]， 2008年上海市疾控中心陈超等从上海市48份自来水样中分离出了戈登分枝杆菌和偶发分枝杆菌[12]。NTM感染动物体后，其临床症状、细菌涂片染色检查、X线检查等方法很难与结核分枝杆菌病相区分[13]，导致很多NTM病被误诊为结核病，同时NTM还能对结核、副结核菌素变态反应产生阳性或假阳性反应，而影响动物检验检疫工作的进行。非结核分枝杆菌感染多发生于育成牛或青年牛[14-15]，而且多呈一次性结核变态反应阳性。2005年，深圳慢性病防治院林世平等[16]从174份牛鼻腔分泌物中分离出分枝杆菌88株，阳性率为50.5%，其中草分枝杆菌20株、偶然分支杆19株、戈登分枝杆菌17株、不产色分枝杆菌13株、土分枝杆菌9株、龟脓肿分枝杆菌 8株和鸟胞内分枝杆菌2株。Hejlicek K等[17]在1966-1990年间对3210只野鸟进行了结核病调查，在5次野鸟病例中都分离到了禽分枝杆菌。1984年Portaels F等[18]对27种野鸟的分枝杆菌感染状况进行了调查，结果分离到1株分枝杆菌，经对分离菌16S RNA基因序列分析表明是日内瓦分枝杆菌（M.genavense）。HoopR K[19]报道了金丝雀和鹦鹉感染了分枝杆菌所引发的的结核病，而且在金丝雀肺脏上见有明显结核病灶。本试验所用麻雀为结核检疫牛场中捕捉所得，无菌操作取肺脏，经研磨后分别进行染色镜检、接种分离培养、多重PCR鉴定。结果21只麻雀肺组织涂片抗酸染色镜检与培养均未获得阳性结果，多重PCR方法成功扩增出2例非结核分枝杆菌，阳性检出率为9.52%，提示该牛场中生物体内存在分枝杆菌潜伏感染，并可能导致牛的潜伏感染以及干扰结核检疫。本试验所建立的多重PCR具有高度的特异性和敏感性，并能同时检测并鉴别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌DNA，根据扩增产物中目的片段的数量，灵敏、快速、准确地检测出临床病料中分枝杆菌感染情况。

[1] Buddle B M. Use of east-6 in the IFN-ɣ test needs for evaluating antituberculosis vaccines[J]. Vet Microbiol， 2001，80（1）：37-46.

[2]陈全. 用抗原诊断结核分枝杆菌感染的免疫学研究进展[J]. 国外医学：临床生物化学与检验学分册，2004，25（5）：456-458.

[3]李金岭，徐青元，周宇等.排除牛结核变态反应中禽结核干扰的研究[J]. 吉林农业大学学报， 2008，30（3）：352-355.

[4]孟祥红，匡铁吉，董梅.应用多重PCR方法快速鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌[J].解放军医学杂志，2007，32（11）：1177-1178，1183.

[5]中国防痨协会.结核病诊断细菌学检验规程[J].中国防痨杂志，1996，18（1）：28-31.

[6]沈德新，封志纯，杜江.细菌DNA提取方法比较 [J].中原医刊，2004，31（10）：21-22.

[7]马秀玲.非结核分枝杆菌的研究现状[J].右江民族医学院学报，2002（6）：897-899.

[8] Porteous N B， Redding S W， Jorgensen J H. Isolation of non-tuberculosis mycobacteria in treated dental unit waterlines[J]. Oral Surgery， Oral Medicine， Oral Pathology，Oral Radiology， and Endodontology，2004， 98（l）：40-44.

[9] Vaerewijck M J M， Huys G， Palomino J C， et al. Mycobacteria in drinking water distribution systems： ecology and significance for human health[J]. FEMS Microbiol Rev，2005，29（5）：911-934.

[10] Jie T， Matas A J， Gillingham K J， et al. Mycobacterial Infections After Kidney Transplant[J]. Transplantation Proceedings， 2005，37（2）：937-939.

[11] Simor A E， Salit I E， Vellend H. Authors’ response[J]. Clin Microbiol Newsletter，1988，10（14）： 111-112.

[12]陈超，徐鹏，李静，等.城市生活饮用水中非结核分枝杆菌调查[J].微生物与感染，2008，3（4）：215-218.

[13] Griff i th D E， Brown-Elliott B A， Wallace R J. Diagnosing non-tuberculous Mycobacterial lung disease： A process in evolution[J]. Infectious Disease Clinics of North America，2002，16（l）：235-249.

[14] Gradon J D， Lutwick L， Lueas S B. Tuberculosis lymphadenopathy and HIV[J] The Lancet，1991，337（8738）：427-429.

[15]张宇，王铁峰，钱爱东.猪、牛源非结核分枝杆菌的分离与鉴定[J].吉林畜牧兽医，2010，31（7）：10-14.

[16]林世平，杨应周，谭卫国，等.牛鼻腔分泌物非结核分枝杆菌分离培养结果分析[J].中国热带医学，2005，5（6）：1207-1209.

[17]Hejlicek K， Treml F. The occurrence of avian mycobacteriosis in wild birds during various epizootic conditions of tuberculosis in poultry[J].Vet Med（Praha）， 1993，38（5）：305-317.

[18]Portaels L， Realini L， Bauwens L， et al. Mycobacteriosis caused by Mycobacterium genavense in birds kept in a zoo： 11 year survey[J].J Clin Microbiol，1996，34（2）：319-323.

[19]Hoop R K. Mycobacterium tuberculosis infection in a canary（Serinus canana L.） and a blue-fronted Amazon parrot（Amazona aestiva）[J].Avian Dis，2002，46（2）： 502-504.

Detection of Mycobacterium in Sparrow Tissues in a Dairy Cattle Farm with Multiplex PCR Assay

Zhou Fangyong1，Jiang Yehui1，Liang Junming2，Li Yan3，Ma Xun1
（1. College of Animal Science and Technology，Shihezi University， Shihezi 832000 ；2.Animal Husbandry and Veterinary Station Twelfth Division of Xinjiang Production and Construction Corps Urumqi 83000； 3. Animal husbandry and veterinary work Terminus of Xinjiang Production and Construction Corps Urumqi 830000）

ObjectiveTo detect the Mycobacterium infection in the tissues of sparrows in a dairy cattle farm with a multiplex PCR assay that can discriminate Mycobacterium tuberculosis，Mycobacterium bovis，and non-tuberculous mycobacteria.MethodThree pairs of primers were designed and synthesized based on the specif i c genes of Mycobacterium tuberculosis （MTP40），the specif i c genes of Mycobacterium（32kD），and the specif i c genes of Mycobacterium tuberculosis complex（IS6110），and used in a multiplex PCR assay for amplif i cation of the 506bp gene of 32kD，the 396bp gene of MTP40，and the 984bp gene of IS6110. The assay was carried out to detect the Mycobacterium infection in sparrow lung tissue in a dairy cattle farm and the positive fragments were cloned and sequenced.Result2 of 21 sparrow lung tissue samples were positive for non-tuberculous mycobacteria with a positive rate of 9.52%. The homology of the 2 positive samples with the 32kD gene in GenBank was 95.8% and 97.2% respectively.ConclusionThe presence of mycobacterial infection in sparrow lung tissues suggested that organisms in the dairy cattle farm had been latently infected with Mycobacterium， possibly causing latent infection with Mycobacterium and thus interfering with TB tests.

Dairy cattle farm； Mycobacterium； Sparrow； Multiplex PCR

S852.618

：A

：1005-944X（2014）01-0081-05

国家科技支撑项目（2012BAD43B02）

马 勋