γ—干扰素释放法检测奶牛结核病的比较试验

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（1.无锡市动物园管理处，江苏无锡 214000；2.无锡市动物疫病预防控制中心，江苏无锡 214021）

γ—干扰素释放法检测奶牛结核病的比较试验

倪谷音1，毛爱民2，范 锋2

（1.无锡市动物园管理处，江苏无锡214000；2.无锡市动物疫病预防控制中心，江苏无锡214021）

目的评价ɣ—干扰素释放试验（IGRA）牛结核病检疫过程中的效果。方法在牛结核病检疫过程中对皮试初筛为结核病和疑似结核病的89（74/15）头奶牛同时进行r干扰素试验、单纯颈部皮试变态反应（SCT）和比较皮试变态反应（CCT）检测，结果单纯颈部皮试变态反应二次检疫中89头牛均判为阳性，单纯颈部皮试变态反应与比较皮试变态反应的阳性符合数为67头。阳性符合率为75.3%；ɣ—干扰素释放试验和单纯颈部皮试变态反应检测两者的阳性符合数为64头，阳性符合率为71.9%；ɣ—干扰素释放试验与比较皮试变态反应的阳性符合数为58头，阳性符合率为79.5 % 。阴性符合数为16头，阴性符合率为48.4 % ；结论ɣ—干扰素释放试验在保持较高灵敏度的同时，具有比变态反应更好的特异性。

牛结核；ɣ—干扰素试验；单纯颈部皮试变态反应；比较皮试变态反应

牛结核病（bovine tuberculosis）是由牛型分枝杆菌等所引起的一种人兽共患的慢性消耗性传染病，被世界动物卫生组织（OIE）列为需通报的动物疫病。目前，我国主要采用牛型提纯结核菌素（PPD）进行单纯颈部皮试变态反应（SCT）来进行牛结核病的检疫，对于阳性牛应进行隔离或扑杀，但是许多被扑杀的牛并没有区分检疫方法可能造成的假阳性，这对牛结核病的检疫，奶牛业的发展造成了巨大的阻力。掌握我市奶牛结核病现状、检测淘汰感染奶牛意义重大，因此采用灵敏度更高、特异性更好的检测方法具有广泛应用价值。为此，本研究旨在ɣ—干扰素释放试验（IGRA）的应用优势，通过比对单纯颈部皮试变态反应（SCT）、比较皮试变态反应（CCT）和ɣ—干扰素释放试验（IGRA）之间的效果，为临床实际应用提供依据。

1 材料与方法

1.1PPD与试剂盒 皮肤试验用牛型PPD和禽型PPD购自中国兽医监察所；IGRA试剂盒购自瑞士Prionics公司。

1.2试验用牛为我市春季奶牛两病监测中单纯牛型PPD初筛为结核病阳性或疑似阳性的奶牛，计89头，其中粗筛判为阳性的74头，可疑的15头。

1.3牛ɣ—干扰素试验奶牛尾静脉无菌采血5mL／头，将采集的血液置于肝素钠抗凝管中，轻轻颠倒混匀，使肝素钠溶解。室温下将血样运送到实验室，在采血后8h内进行刺激培养。将全血样品无菌分装至24孔板中，每份血样分装3孔，1.5ml／孔。向各孔中分别无菌加入100μL PBS、Avian PPD、Bovine PPD，震荡混匀1min。将含有血液与抗原的24孔板置于37℃湿温培养箱中孵育24h。次日从各培养孔吸取500μL血浆上清转入1.5mL离心管中，即为刺激产生的ɣ—干扰素上清。以Prionics公司购得的试剂盒检测牛全血上清液中的ɣ—干扰素，具体操作参照试剂盒说明书进行。结果判定标准：牛型PPD刺激上清的OD值-PBS刺激上清的OD值≥0.1，且牛型PPD刺激上清的OD值—禽型PPD刺激上清的OD值≥0.1判为阳性；牛型PPD刺激上清的OD值—PBS刺激上清的OD值＜0.1或牛型PPD刺激上清的OD值—禽型PPD刺激上清的OD值＜0.1判为阴性。

1.4单纯颈部皮试变态反应试验参照国家标准《动物结核病诊断技术（GB／T18645—2002）》进行，仅采用牛型PPD在奶牛颈部进行皮试变态反应，剂量为2000国际单位（IU）/头，分别于注射前和注射后72h测量皮肤厚度，并计算出皮厚差，依据国家标准判断结果，对粗筛和二次复核均为可疑的判为阳性。

1.5比较变态反应试验参照OIE《动物疫苗和诊断手册》中牛结核病诊断方法进行，该方法在欧盟（EU）国家广泛使用，并以议会指令64/432/ EEC推荐。在牛颈部同时分点注射牛型和禽型PPD，使用剂量均为2000IU/头，禽型PPD注射位点在牛型PPD下方间隔约10～15cm处。分别于注射前和注射后72h测量牛型PPD和禽型PPD注射处的皮肤厚度，并计算出各自的皮厚差。如果牛型PPD的皮厚差大于禽型PPD的皮厚差且超过4mm判为阳性，1～4mm为可疑，小于或等于禽型PPD的皮厚差为阴性。

2 结果

2.1SCT 、CCT、 IGRA 三种方法对89头牛的检疫结果为：SCT 检出阳性89头，检出率（复核判定）100%，CCT检出阳性67头，检出率（与SCT符合率）75.3%，IGRA检出阳性64头，检出率（与SCT符合率）71.9%。

表1 SCT 、CCT、 IGRA三种牛结核病检疫方法的比较

2.2CCT、 IGRA二种方法对检出的阳性牛的结果差异为：共同检出为阳性的58头，阳性符合率79.5%，共同检出阴性的16头，阴性符合率48.4%，检出结果有差异的15头，其中CCT阳性而IGRA阴性的9头，IGRA阳性而CCT阴性的6头。

表2 CCT、 IGRA二种方法对检出的阳性牛的结果比较

3 分析和讨论

3.1牛结核活畜检疫中的方法选择 牛结核病的诊断方法主要有病原学诊断和免疫学诊断。病原学诊断包括传统的细菌学检测和分子生物学诊断技术。但目前分子生物学诊断技术（PCR诊断）敏感性较差，细菌学检测则需要采集死亡家畜的病料来检测，因此病原学诊断不适合大规模的活畜检疫。牛结核病的免疫学检测方法包括血清学检测和细胞免疫检测，一般认为分枝杆菌引起的机体免疫应答以细胞免疫为主，因此检测特异性抗体的EIISA方法应用价值受限。目前在我国牛结核病检疫过程中，主要采用SCT，但该方法存在较多的假阳性。另外，该方法具有操作过程困难、试验所需时间较长、受外界干扰因素较多、结果判定主观性较强等一系列缺陷。在本实验过程中，我们将SCT 、CCT、IGRA进行了比较分析。结果显示虽SCT具有较高的检出率，但其特异性不好。

3.2目前在牛结核检疫方法中最有应用价值和前景的是抗原特异性牛ɣ—干扰素试验，其基本原理同结核菌素皮内变态反应，但整个操作过程在体外进行。牛型、禽型PPD同时刺激可以有效区分牛分枝杆菌感染和环境中的禽分枝杆菌的干扰。该方法克服了皮试变态反应的技术性、主观性以及环境分枝杆菌的干扰问题，同时还可以同其他疾病的检测相结合，尤其是奶牛两病普查时可以进行一次采血后可以同时进行牛结核病和布鲁氏菌病的检测，既节省了人力物力和时间，又可以减少对奶牛的刺激，防止造成产奶量的下降。

3.3IGRA已被OIE认可，可作为牛结核病的辅助确诊试验，并在欧盟、美国、澳大利亚和新西兰被批准为正式试验。以IGRA作为结果判定标准，可排除25头牛感染牛结核病，削减损失。实验结果显示，SCT虽具有较好的敏感性，阳性检出率明显高于IGRA，但与IGRA相比。特异性较低，可能的主要原因之一是SCT检出的阳性牛中，有相当一部分是由禽结核感染照成的干扰，通过CCT法也可证实这一特点。IGRA法敏感性和特异性与OIE《动物疫苗和诊断手册》在欧盟（EU）国家广泛使用CCT法对比，本实验显示者的差异性不大，可推荐使用，且前者保持较高灵敏度的同时，具有后者更好的特异性。

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农业部副部长于康震要求加强畜禽屠宰行业管理 保障畜禽产品安全

农业新闻网 12月20日上午，农业部召开全国畜禽屠宰行业管理视频会议，认真学习贯彻中央经济工作会议及国务院机构改革和职能转变精神，研究落实畜禽屠宰监管职责调整，加强畜禽屠宰行业管理，确保畜禽产品安全。农业部副部长于康震强调，要充分认识做好畜禽产品安全监管工作的重要意义，切实增强责任感、使命感和紧迫感，认真梳理畜禽产品安全监管工作主要任务，以改革的精神、创新的方法、强有力的措施做好畜禽产品安全监管工作。

A Comparative Study of γ—Interferon Release Assay in Bovine Tuberculosis

Ni Guyin1，Mao Aimin2，Fan Feng2
（1.Wuxi Zoo Management Off i ce， Wuxi， Jiangsu 214000；2. Wuxi Center for Animal Disease Prevention And Control， Wuxi， Jiangsu 214021）

ObjectiveTo evaluate the effect of ɣ—interferon release assay （IGRA） in bovine tuberculosis detection.Method89（74 positive/15 suspicious） dairy cows preliminarily screened with skin test were tested byɣ—inerferon release assay （IGRA）， simple cervical allergy skin test （SCT） and comparative allergy cervical test （CCT）.Result89 cows were considered as bovine tuberculosis positive in SCT， and 67 of them were considered as positive in CCT with the positive coincidence of 75.3%. 64 cows were considered as positive both in IGRA and SCT with the positive coincidence of 71.9%. 58 cows were considered as positive both in IGRA and CCT， with the positive coincidence of 79.5%. 16 cows were considered as negative， with the negative coincidence of 48.4%.ConclusionThe ɣ—interferon release was of higher sensitivity and better specif i city than the other two allergy tests.

bovine tuberculosis； ɣ—interferon release assay； simple cervical allergy skin test； comparative allergy skin test

S852.618；S855.2

：B

：1005-944X（2014）01-0064-03

江苏省2012农业三新工程《奶牛布病，结核病防治集成技术的推广应用》项目资助，SXGC[2012]032