新疆小反刍兽疫疫情诊断

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（1. 中国动物卫生与流行病学中心国家外来动物疫病诊断中心，山东青岛　266032；2.新疆伊犁州动物疾病控制与诊断中心，新疆伊犁　835000；3. 新疆伊犁州霍城县畜牧兽医站，新疆霍城　835200；4. 新疆维吾尔自治区动物疫病预防控制中心，新疆乌鲁木齐　830000）

新疆小反刍兽疫疫情诊断

王清华1，刘春菊1，吴晓东1，王华1，王明国2，王永生2，田建龙3，盛卓君4，林汉亮4，马伟4，李林1，任炜杰1，王淑娟1，赵文年1，包静月，王志亮

（1. 中国动物卫生与流行病学中心国家外来动物疫病诊断中心，山东青岛266032；2.新疆伊犁州动物疾病控制与诊断中心，新疆伊犁835000；3. 新疆伊犁州霍城县畜牧兽医站，新疆霍城835200；4. 新疆维吾尔自治区动物疫病预防控制中心，新疆乌鲁木齐830000）

2013年12月新疆伊犁州霍城县发生不明山羊疫情，根据临床症状和剖检变化怀疑为小反刍兽疫感染。对3只病死山羊病料、8只患病山羊分泌物棉拭子样品和6只患病山羊血清样品分别进行病原学和血清学检测。利用竞争ELISA试剂盒对6份血清样本进行抗体检测，结果全部为阳性。利用抗原捕获ELISA试剂盒，在11只病羊 样品中都检测到小反刍兽疫抗原。利用能特异性检测小反刍兽疫病毒的荧光定量RT—PCR方法，在11只病羊样品中检测到小反刍兽疫病毒核酸。利用特异引物进行PPRV N基因片段RT—PCR反应，从11只病羊样品中检测到PPRV核酸。针对2号样本病原核酸N基因和F基因片段进行序列同源性比较，结果该毒株与西藏流行株序列片段相似性分别为96.5%和97.5%。遗传进化分析，该病原属于谱系4，与巴基斯坦等国流行毒株遗传关系最近。

小反刍兽疫；小反刍兽疫病毒；遗传进化分析

小反刍兽疫（Peste des Petits Ruminants， 简称PPR）是一种感染山羊、绵羊和野生小反刍兽的严重的烈性、接触性传染病，特征为发热、口腔及舌黏膜糜烂、流泪、流鼻液、腹泻和肺炎。本病是世界动物卫生组织（OIE）法定报告的动物疫病，我国将其列入一类动物疫病。本病发病率可达100%，严重暴发期病死率为100%，中等暴发期病死率不超过50%。小反刍兽疫最早于1942年发生于西非，1970年至1972年间，PPR首次在东非国家苏丹发生，1983年传至阿拉伯半岛，1987年传至印度南部。在非洲，PPR流行于中部和北部非洲。在亚洲，PPR在中东、中亚和南部亚洲的大部分国家流行，对我国西部边境省份形成包围态势[1]。从遗传进化关系上，PPRV可分为4个谱系，谱系4分布最广，分布于南亚、中东和北部非洲，谱系3分布于中东和东非，谱系1和2仅见于非洲[2]。

2007年7—9月，我国西藏首次暴发PPR疫情[3]。该疫情涉及西藏阿里地区革吉县、日土县、扎达县和改则县4个县、10个乡镇、13个村，共出现20个疫点，羊发病6122只，死亡1888只[4]。流行病学调查结果表明，2005年PPR可能就曾经传入与印度接壤的日土县热角村，但未被确诊。PPR可能从印度传入，在阿里境内缓慢向东扩散[3]。2008年西藏阿里地区革吉县文布当桑乡罗玛村发生野生岩羊小反刍兽疫疫情，未见家畜发病[5]。2008年6月初，在那曲地区尼玛县双湖区嘎措乡发生PPR疫情。2010年5月，阿里地区日土县多玛乡乌江村斯亚点发生PPR疫情。我国西藏PPRV流行毒株属于谱系4，与印度等国流行毒株遗传进化关系最近[3]。通过采取扑杀、大规模免疫、检疫和移动控制、野生动物控制等综合防控措施，上述疫情得到有效控制。此后，我国再无新的PPR疫情报道。

2013年11月27日，新疆伊犁州霍城县发生不明山羊疫情。本研究经临床症状、剖检变化、病原学和血清学诊断，确诊该起疫情为小反刍兽疫病毒感染。这是我国新疆首次报道发生小反刍兽疫疫情。

1　材料和方法

1.1疫情概况

霍城县兽医站于2013年11月27日接到霍城县三宫乡兽医站报告，霍城县三宫乡一村民饲养的2700只山羊，发病山羊1000余只，陆续死亡100多只。

1.2样品采集

采集发病6只发病山羊的血清，采集8只发病山羊的口鼻棉拭子，解剖三只发病山羊，分别采集肺、肺门淋巴结、肺气管、脾、肾、大肠、肠淋巴结、肝等组织，送中国动物卫生与流行病学中心进行检测。

1.3实验室诊断

对于送检样品开展小反刍兽疫的检测。对血清样品用竞争ELISA试剂盒（英国BDSL公司）检测小反刍兽疫抗体。取适量组织样品加PBS进行研磨，制备组织匀浆液，将组织匀浆液和棉拭子样品分别进行小反刍兽疫抗原检测和病毒核酸检测。抗原检测使用小反刍兽疫抗原捕获ELISA试剂盒（英国BDSL公司）。

病毒核酸检测使用两种方法，分别为荧光定量RT—PCR[6]和基于N基因的RT—PCR[7]。对荧光定量RT—PCR和RT—PCR阳性的样品分别进行N基因片段和F基因片段的扩增和序列测定。

1.4病毒分子特性分析

使用本中心数据库和GenBank下载的小反刍兽疫病毒基因序列，分别针对N基因编码序列的1253～1507 nt片段序列和F基因编码序列的254～575 nt片段序列，使用MegAlign软件进行序列比对和相似性比较，使用MEGA4软件进行遗传发生分析，构建进化树。

2　结果

2.1现场调查

霍城县三宫乡一村民饲养的2700只山羊，发病山羊1236只，陆续死亡203只。发病率为45.8%，病死率为16.4%。

2.2临床症状

病山羊精神不振，呼吸困难，腹式呼吸，呼吸次数58次/分钟，咳嗽，鼻腔和眼睛有脓性分泌物。体温升高至38.8～40.1ºC不等，腹泻，有个别流产。（图1）

图1　发病山羊的临床症状

2.3剖检变化

共解剖四只山羊，剖解变化有，心脏增大、壁变薄。一侧肺胶冻状纤维素性物渗出，肺充血，肺、纵膈、心包粘连，气管出血。肺门淋 巴结出血。肝肿大，呈土黄色，胆囊肿大。大肠粘膜充血，肠系膜淋巴结炎充血肿大，化脓。大肠粘膜出血、糜烂、有条纹状出血。肾脏有出血点和水肿，脾脏无明显变化。上消化道没有明显病变（图2）。

图2　发病山羊剖检变化

2.4抗体检测

六份发病山羊血清样品经小反刍兽疫竞争ELISA方法检测，都为PPRV特异性抗体强阳性。

2.5抗原检测

三只病死山羊的组织样品和8只发病山羊的口鼻棉拭子样品，经小反刍兽疫病毒抗原捕获ELISA检测，都为阳性。

2.6小反刍兽疫病毒荧光定量RT—PCR检测

结果显示，从三只病死山羊的组织样品和8只发病山羊的口鼻棉拭子样品中，都能检测到特异性扩增曲线，Ct值为20.51～33.47（见图3）。

2.7小反刍兽疫病毒RT—PCR检测

结果显示，三只病死山羊的组织样品和8只发病山羊的口鼻棉拭子样品，在350 bp左右都有特异性扩增条带，与阳性对照一致（图4）。

2.8N和F基因片段序列比较和遗传发生分析

图3　实时定量RT—PCR扩增结果

图4　病羊组织样本RT—PCR检测结果

针对2号样本进行PPRV N基因片段和F基因片段的扩增，对PCR产物进行序列测定，获得长度为255 bp的N基因片段序号和长度为322 bp的F基因片段序列。与数据库和GenBank下载的相应序列进行序列比对，结果显示，N基因片段与小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1疫苗株的同源性为87.5%，与西藏流行株的同源性为96.5%，与阿联酋2009年Ibex株及巴基斯坦2012年流行毒株序列相似性为98.4%。F基因片段与小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1疫苗株的同源性为92.7%，与西藏流行株的同源性为97.5%，与巴基斯坦2007年分离株序列相似性为99.7%，与Iran2010年流行株相似性为99.4%（表1）。

N基因片段序列的遗传发生分析显示，该毒株属小反刍兽疫病毒谱系I V，与巴基斯坦2010及2012年流行毒株、塔吉克斯坦2004年流行毒株以及阿联酋2009年Ibex株遗传发生关系最近，与西藏2007年流行毒株分别属于两个小分支（图5左）。F基因片段序列的遗传发生分析表明，该样本病毒属于谱系IV，与与巴基斯坦2010年流行毒株、伊朗2010年流行毒株遗传发生关系最近，同样，与西藏2007年流行毒株分别属于两个小分支（图5右）。

3　讨论

2007年西藏首次发现小反刍兽疫，本实验室所做的毒株遗传进化分析结果表明，其来源于印度流行株[8]，随后，在流行病学调查中得到证明[9]。根据临床症状和剖检变化，通过抗体检测、抗原检测、病毒核酸检测，对新疆首例小反刍兽疫疫情进行确诊，基因序列同源性分析以及遗传进化分析结果显示，新疆PPRV毒株也属于谱系4，但是为独立于西藏流行株的一个新毒株。此次新疆PPRV毒株与巴基斯坦等国流行毒株遗传关系较近，表明其由周边国家传入的可能性最大。

表1 小反刍兽疫病毒新疆毒株与周边国家流行毒株部分基因序列同源性分析（%）

图5　针对China/XJYL/2013 N基因编码序列1253-1507nt片段序列（左图）和F基因编码序列254-575 nt片段序列（右图）进行遗传发生分析

新疆陆地边境线5600多公里，周边与哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦、塔吉克斯坦、巴基斯坦、蒙古、印度、阿富汗、俄罗斯等八个国家接壤。在这八个国家中，小反刍兽疫在印度、巴基斯坦、阿富汗等国呈地方性流行，而塔吉克斯塔和哈萨克斯坦也曾有PPR疫情报道。2013年9月，塔吉克斯塔向OIE报告发生PPR疫情。但是，新疆历史上从来没有PPR疫情报道。根据调查，发病羊群所在疫点为一新建的养殖小区，养殖户从羊贩处购得羊只用于育肥后出售。养殖密度大，而且冬季草料缺乏，羊只营养状况差，是发生疫情的诱因。目前，需要尽快开展疫情溯源。

[1] Banyard A C， S Parida， C Batten， et al. Global distribution of peste des petits ruminants virus and prospects for improved diagnosis and control [J]. J Gen Virol 2010，91：2885-2897.

[2] Dhar P， B P Sreenivasa， T Barrett， et al. Recent epidemiology of peste des petits ruminants virus （PPRV） [J]. Vet Microbiol，2002， 88：153-159.

[3] Wang Z， J Bao， X Wu， et al. Peste des petits ruminants virus in Tibet， China [J]. Emerg Infect Dis，2009，15：299-301.

[4] 王乐元， 次真， 吴国珍， 等. 中国西藏小反刍兽疫的发生状况与防控 [J]. 畜牧兽医学报，2011，42：717-720.

[5] Bao J， Z Wang， L Li， et al. Detection and genetic characterization of peste des petits ruminants virus in freeliving bharals （Pseudois nayaur） in Tibet， China [J]. Res Vet Sci，2011，90：238-240.

[6] 包静月， 李林， 王志亮， 等. 一步法实时定量RT—PCR检测小反刍兽疫病毒方法的建立 [J]. 中国动物检疫，2007，24（8）：21-23.

[7] Couacy-Hymann E， F Roger， C Hurard， et al. Rapid and sensitive detection of peste des petits ruminants virus by a polymerase chain reaction assay [J]. J Virol Methods，2002，100：17-25.

[8] 王志亮， 包静月， 吴晓东， 等. 我国首例小反刍兽疫诊断报告 [J]. 中国动物检疫，2007，24（8）：24-26.

[9] 陆则基， 王志亮， 刘雨田， 等. 西藏阿里地区小反刍兽疫流行病学调查研究 [J]. 中国动物检疫，2008，25（12）：44-47.

Diagnosis of Peste des Petits Ruminants in goats in Xinjiang China

Wang Qinghua1，Liu Chunju1，Wu Xiaodong1，Wang Hua1，Wang Mingguo2，Wang Yongsheng2，Tian Jianlong3，Sheng Zhuojun4，Lin Hanliang4，Ma Wei4，Li Lin1，Ren Weijie1，Wang Shujuan1，Zhao Wennian1，Bao Jingyue，Wang Zhiliang
（1. National Exotic Animal Disease research Center， China Animal Health and Epidemiology Center， Qingdao 266032； 2. Yili Region Animal Disease Control and Diagnosis Center， Yili， Xinjiang 835000； 3. Huocheng County Animal Husbandry and Veterinary Station， Yili， Xinjiang 835200； 4. Xinjiang Animal Disease Prevention and Control Center， Urumqi 830000）

An outbreak of Peste des Petits Ruminants-like disease in goats were reported in Huocheng county in Yili region of Xinjiang province. Clinical samples including tissue samples from 3 goats， oral swabs from 8 goats and sera from 6 goats were collected and sent to the laboratory. A number of diagnostic tests were used， including one step realtime RT—PCR， conventional RT—PCR， competitive ELISA and immunocapture ELISA. The presence of PPRV was detected in all the infected animals. Sequence analysis based on N and F gene partial sequence showed that the virus share a similarity of 96.5% （N） and 97.5% （F） with Tibet/07. Phylogenetic analysis showed that the virus fell into lineage 4， showing closely related to the virus from Pakistan.

Peste des Petits Ruminants；Peste des Petits Ruminants virus；Phylogenetic analysis

S851.3

：A

：1005-944X（2014）01-0072-04

农业部动物疫情监测项目，公益性行业（农业）科研专项经费

王志亮，包静月

注：刘春菊，吴晓东为贡献相同作者