对山东某猪场一起仔猪腹泻的流行病学调查

（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

对山东某猪场一起仔猪腹泻的流行病学调查

张 志，董雅琴，刘 爽，吴发兴，邵卫星，李晓成

（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

本文针对发生腹泻疫情的某猪场开展了实验室检测和流行病学调查，实验室检测表明该疫情的病原为猪流行性腹泻病毒。流行病学调查显示，此次腹泻疫情于2013年11月份开始暴发，2014年3月份结束，发病猪的种类具有明显的次序，育肥猪首先发生，其次是母猪，新生仔猪最后发病；发病率和死亡率与猪的种类、日龄密切相关，育肥猪和母猪发病后仅出现腹泻症状而不死亡，仔猪发病后腹泻症状明显而且死亡率随着年龄的增长急剧下降，3日龄以下仔猪死亡率可达100%，1周龄仔猪死亡率降至72.73%，12日龄仔猪死亡率仅有10%。对猪场风险因素分析表明，饲料车辆直接进入猪场、卖猪车辆与饲养人员接触、粪便通道没有封闭、饲养人员流动等是影响此次腹泻疫情的高风险因素，通过降低高风险因素很好地控制了疫病。

猪流行性腹泻；流行病学调查；检测

猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diahorrea Virus，PEDV）是引起猪呕吐、腹泻和脱水为主要临床症状特征的猪肠道传染病病原，哺乳仔猪、架子猪或育肥猪等各年龄段均可发病，但哺乳仔猪发病和死亡最为严重[1]。2011年以来，因猪流行性腹泻病毒引起的腹泻在我国猪群迅速传播，仔猪一旦感染发病，死亡率可达60%～100%，给养猪业带来了巨大的经济损失[2-4]。2014年3月，山东某养殖场暴发腹泻疫情，仔猪出现大规模的腹泻、呕吐、死亡等症状，该场迅速采样送我中心进行检测，经实验室检测证实样品全部为猪流行性腹泻病毒阳性，为进一步寻找病原来源，提出防治措施，我中心对该场又进行了流行病学调查，并针对此次疫情提出了针对性的防控建议。

1 材料和方法

1.1 样品来源

7头呈现腹泻症状的死亡小猪，日龄分别为2-12日龄，来自山东某猪场，剖检后取其肠道和粪便样品进行实验室检测。

1.2 试剂

PEDV RT-PCR的引物由本实验室自行设计，RNA提取试剂盒TRIzol购自Invitrogen公司，反

转录酶AMV、Taq酶等购自TakaRa公司，其余试剂均为分析纯产品。

1.3 实验室PEDV 核酸检测

1.3.1 猪粪便样品的处理和RNA的提取

每一份粪便和肠道样品均在一起，按照1∶5的比例加入PBS缓冲液，5000rpm 4℃离心10min，然后吸出上清液用于提取RNA和接种细胞。RNA的提取根据试剂盒的说明书进行，即取粪便悬液250μL于1.5mL的离心管中，加入750μL TRIzol（Invitrogen公司），混匀，室温放置5min；再加入200μL氯仿，振荡混匀，室温放置10min；12000r-min、4℃离心15min，取上清500μL，加等体积-20℃预冷的异丙醇室温静置10min或-20℃静置30min，12000r-min、4℃离心10min；弃上清，加入75%冰冷乙醇（DEPC处理水配制），8000～9000g离心5min；弃上清，倒置风干，用20μLDEPC处理水溶解，-20℃冻存备用。

1.3.2 检测引物

根据参考文献[5]，设计2对引物，进行巢氏PCR扩增，一扩引物的扩增产物预计为854 bp，序列为：L12：5’-ACACCTATAGGGCGCCTGTA-3’；L13：5’-AACCCTAAGAGGGGCATAGA-3’；二扩引物的扩增产物应为412 bp，其序列为：PA：5’-GGGCGCCTGTATAGAGTTTA-3’；PB：5’-AGACCACCAAGAATGTGTCC-3’。引物由上海生工合成。使用时稀释至20μm。

1.3.3 RNA病毒的检测

首先制备cDNA，cDNA反应体系为：RNA 5μL，dNTP 4μL，5×AMV Buffer 4μL，反转录引物L131μL，AMV 0.5μL，HPRI 0.5μL，加入适量DEPC水，总体积为20μL。42℃恒温水浴锅中水浴1.5h，取出后放入-20℃冰箱保存备用。PCR扩增：取反转录的cDNA 2.0μL作为模板，加入10×PCR Buffer 2.5μL，dNTPs（10 mmol-L）2μL，分别加入PEDV的引物L12和L13各0.5μL，Ex-Taq DNA聚合酶0.25μL，ddH2O 17.25μL。混匀后采用如下程序进行PCR扩增：94℃预变性3min；94℃ 40s，56℃1min，72℃ 1min，30个循环；72℃延伸10 min。巢式PCR扩增：取上述PCR产物0.5μL，用引物PA和PB进行二次扩增，反应条件如下：94℃预变性3 min；94℃ 30s，56℃30s，72℃ 30s，32个循环；72℃延伸10 min。

1.3.4 PCR产物检测 取10μL 一次和二次扩增的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中进行观察有无特异性条带。

1.4 流行病学调查

发放和填写《猪群腹泻等常见病流行病学调查表》，进行现场调查和谈话，重点调查发病史、发病背景、发病范围、发病率、死亡率、猪场与外界的接触史、猪场卫生管理情况、防疫管理措施、生产记录、用药记录以及现有疫苗的临床免疫保护效果等，对返回的数据及时进行统计分析。

1.5 分析方法

用描述性流行病学方法和Excel软件对采集的数据进行分析。

2 结果

2.1 样品的实验室检测结果

该猪场共送来7头死亡仔猪剖检，分别来自7头不同母猪，这些仔猪生前均出现呕吐、拉稀、脱水等症状，剖检后发现仔猪的肠道变薄肿胀（7/7）、充满黄白色液体（7/7）、脑回沟变深充血和弥漫性出血（7/7）、胃内充满白色乳样凝块（5/7），其他组织没有发现明显病变。每头仔猪分别采集脑组织、粪便和一段小肠（约30cm长）混匀后进行多种病原检测，结果7份样品均检测到了PEDV，而没有检测到TGEV、CSFV、PRRSV、PRV等病原。

2.2 流行病学调查结果

该猪场2008年建设和投入生产，引种后采取自繁自养的养殖模式，现存栏公猪17头，能繁母猪700头，后备母猪120头，断奶前仔猪800头，保育猪1200头，育肥猪4300头。猪场有专职兽医，养殖环境相对独立，有门禁、消毒设施，采取进场前消毒、换胶鞋等卫生防疫措施。妊娠母猪产前20和40天分别免疫猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联灭活苗。2013年12月份，猪场开始出现腹泻，抗生素治疗无效。从发病时间看，最初为育肥猪，其次为母猪和仔猪，母猪和育肥猪基本没有死亡，

呈一过型，但仔猪死亡率很高，可达70%以上。

2.3 病例的时间分布

该场猪群出现腹泻的时间与猪的种类密切相关。首先是育肥猪，然后是母猪，最后是仔猪。时间分布详见图1。

图1不同猪发病和结束时间

表1不同种类猪腹泻发生的状况

表2仔猪日龄与发病的关系

图2猪场平面图

2013年11月5日左右，育肥后期猪（约200斤）最先开始发病，接着育肥前期、育肥中期猪和保育猪发病，主要症状为不吃料、拉稀、水样腹泻，持续1周，然后自愈，截至11月22日，无新发病例出现，4300头育肥猪共有3912头猪出现发病，发病率为91%，1200头保育猪共有1056头发病，发病率为88%，但没有一头猪死亡。2013年12月15日，母猪开始出现腹泻症状，至12月31日，母猪无新发病例出现，700头母猪中有50头表现拉稀，发病率为7.2%，但一般2天后自愈，呈现一过性，无母猪死亡。2014年1月，仔猪开始集中发病，至3月中旬，除了50头发病母猪所产仔猪以外，其余母猪所产的新生仔猪都发病。1-3月期间，共有6栋产仔舍进行使用，每半月轮换一批母猪，先后有220头母猪生产，共产活仔2089头，3月上旬第6栋母猪舍在使用，该栋有40头母猪存栏，已经生产23窝，其中16窝仔猪（163头）也出现拉稀，但呈一过型，没有出现仔猪死亡，其余7窝（80头）的仔猪出现明显的腹泻症状，10日龄以上仔猪不死亡，但3日龄以下仔猪100%死亡，这7窝仔猪的平均死亡率为61.25%，如果考虑到16窝一过性仔猪，总体平均死亡率为20.16%，详见表1。

进一步分析这7头母猪所产仔猪的发病和死亡时间，可以发现，仔猪日龄越大，死亡率越低，3日龄以内发病的仔猪死亡率为100%；1周左右时，发病率降至72.73%，当达到12日龄时，死亡率只有10%（表2）。

2.4 病例的空间分布

该猪场占地面积72亩，离周边最近居民1.2公里，隔离屏障相对较好，猪场分为生产区和办公区，但二者之间只有一条道路相隔，没有明显的隔离屏障（猪场的平面图如图2所示）。此次疫情中，最先发病的是育肥舍5，然后是育肥舍6、2、1、3、4、7、8、9、10和保育舍。育肥舍与产仔舍的最短距

离为250m。产仔舍的发病顺序是2、4、5、3、1。产仔舍6用于50头出现腹泻症状的母猪，该50头母猪所产仔猪均没有发病。从图中可以明显地看出，疫病是从育肥舍传向母猪舍，然后传向产仔舍，显然育肥舍5是最初的传染源。

2.5 病例的群间分布

此次腹泻疫情，涵盖了育肥猪、母猪和仔猪，但不同种类的猪出现的症状、持续时间和最终转归结果明显不同，差异非常显著。育肥猪发病快，传播迅速，感染率高，一般呈一过性，症状主要表现水样腹泻，病程1周左右，能够自愈，没有出现死亡；母猪呈散在发生，发病率低，症状较轻，以拉稀为主，病程短，多2天自愈，没有出现死亡；仔猪则表现发病快，传播迅速，症状严重，表现水样腹泻、严重脱水、极度消瘦等，一窝仔猪往往全部发病，死亡率与猪的日龄密切相关，出生3日龄内出现腹泻症状，死亡率100%；出生1周内出现腹泻症状，死亡率可降至60%；超过10日龄的仔猪，死亡率不超过20%。

2.6 风险因素分析

在调查中，结合该猪场的养殖模式考虑了以下几种引发疫病发生和传播的风险因素，以及这些风险因素在该养猪场引发风险的可能性高低，其中，风险性比较高的因素有饲料车辆直接进入猪场、卖猪车辆与饲养人员接触、粪便通道没有封闭、饲养人员流动等，详见表3。

表3猪场腹泻风险因素分析表

通过此次调查，针对风险性高的风险因素，我们提出了加强猪舍消毒，更换腹泻疫苗，母猪强化免疫，严防外来车辆进入猪场等措施，该猪场的腹泻很快停止，取得了明显的效果。

3 讨论

流行病学调查是流行病学的一种基本研究方法，旨在通过调查了解疫病的空间、时间和群间分布，判断病因，提出相应的防控措施。本文也是作者将流行病学调查和实验室检测相结合的一种尝试，通过这种方式，既能够明确病因，确定风险因素，也能够更有针对性地提出有效合理的防控措施[6-7]。

2011年以来，我国部分猪场暴发了仔猪腹泻，一些学者先后从腹泻样品中检测到PEDV，甚至PEDV的阳性率可达80%以上[3-4]。但直到2013年底，仔猪腹泻仍在我国部分猪场肆虐，最近美国又大规模暴发了猪流行性腹泻，这些结果提示，仅仅依靠病原的分离鉴定并不能完全阻止腹泻疫情的暴发，必须开展相关的流行病学调查。

2011—2013年，我中心对全国29个省份的7021个猪场开展了腹泻流行病学问卷调查，结果表明有4060个猪场（57.83%）发生过腹泻，而且猪场免疫猪流行性腹泻-猪传染性胃肠炎二联活疫苗或二联灭活苗保护仔猪的效果并不显著，本文的调查也显示同样的结果。另外，本文调查也显示，育肥猪特别是距离售猪口最近的育肥猪是此次疫情发生的传染源。据猪场主回忆，2013年10月份，每隔1周，该猪场都会出售一批猪，最近一次10月25日时，有一头猪赶上车辆后又逃回猪场，这头猪当时没有出售，我们推测这头猪很可能是此次疫情的污染源。其原因在于去年冬季，山东省不少猪场发生了猪流行性腹泻，一旦猪场发病后，场主往往急于销售病猪，猪贩子收购病猪以后，装载该病猪的车辆就会携带猪流行性腹泻病原，加上冬季病原不易灭活，病原可以长时间存活，并随着车辆的运输而长距离传播。当猪贩子的载猪车辆在不同的猪场之间来回流动购猪时，就会成为下一家猪场的传染源。如果猪场的卫生防疫措施不严格、猪场内的粪便运输和处理等管理措施不当，就会导致全场暴发疫病。

针对相关风险因素，经实施加强猪舍消毒、更换腹泻疫苗、严防外来车辆进入猪场等措施，该猪场疫情停止，证实我们对风险因素的判断是正确的。

[1] Daesub Song，Bongkyun Park. Porcine epidemic diarrhoea virus： a comprehensive review of molecular epidemiology，diagnosis，and vaccines[J]. Virus genes，2012 ，44 （2）：167 -175.

[2] Yueyi Gao，Qiuwen Kou，Xinna Ge，et al. Phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus field strains prevailing recently in China[J]. Arch Virol，2013，158（3）：711-715.

[3] Qian Zhang，Ruiming Hu，Xibiao Tang，et al. Occurrence and investigation of enteric viral infections in pigs with diarrhea in China[J]. Archives of virology，2013 ，158（8）：1631-1636.

[4] Sun Rui-Qin，Cai Ru-Jian，Chen Ya-Qiang，et al. Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets，China[J]. Emerging Infectious Diseases，2012，18（1）：161-163.

[5] 张志，李岚，董雅琴，等. 猪流行性腹泻病毒PCR检测及其M基因的遗传变异分析[J]. 动物医学进展，2013，34（8）：13-18.

[6] 黄保续. 兽医流行病学[M]. 北京：中国农业出版社，2010.

[7] 张传亮，陈星宇，赵灵燕，等.浙江省猪病毒性腹泻流行病学调查及防控对策[J].中国动物检疫，2013，30（7）：47-48.

A epidemic survey of porcine diarrhea in a pig farm

Zhang Zhi，Dong Yaqin，Liu Shuang，Wu Faxing，Shao Weixing，Li Xiaocheng

（China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao 266032）

A epidemic survey and laboratory detection were carried out for a pig farm which occurred diarrhea. The detection of virus was conf rmed the epidemic agent was porcine epidemic diarrhea virus. Further information of survey showed that this outbreak of diarrhea took place during Nov 2013 and Mar 2014 in sequence of fattening pigs，sows and piglets. However，the morbidity and mortality of different pigs were closely related to the pieces and birth days. Fattening pigs and sows had no deaths although they had been infected，while the piglet less than 3 old days had 100 percent mortality. If the piglets grown up to one week and 12 days，the mortality would drop to 72.73% and 10% separately. The risk analysis indicated that vehicles directly went into pig farms，a closed contact with their keepers by selling pigs，unclosed transfer channel of feces and urine，circulating of feed workers were all high risk factors inf uencing the diarrhea outbreak，which could be reduced to control the disease.

porcine epidemic diarrhea；epidemic survey；detection

S852.65

：B

：1005-944X（2014）10-0052-05

青岛民生计划项目（13-1-3-91-nsh）

李晓成