转化生长因子β1在大鼠睾丸及附睾中的表达研究

艾庆燕，赵豫凤，杨加周，王艳梅，苗乃周

（延安大学医学院组织学与胚胎学教研室，陕西延安716000）

转化生长因子β1在大鼠睾丸及附睾中的表达研究

艾庆燕，赵豫凤，杨加周，王艳梅，苗乃周

（延安大学医学院组织学与胚胎学教研室，陕西延安716000）

目的通过研究转化生长因子（TGFβ1）在大鼠睾丸、附睾中的表达特征，探讨其在男性生殖系统中的作用。方法用免疫组化SP法检测TGFβ1蛋白在青春期SD大鼠睾丸、附睾中的表达与定位。结果TGFβ1在大鼠睾丸和附睾中都有特征性表达。TGFβ1蛋白在睾丸内表达于生精细胞、精子细胞、支持细胞和间质细胞胞质及顶体；附睾中表达于主细胞胞质内，附睾上皮亮细胞、晕细胞和基细胞中均为阴性。结论大鼠睾丸、附睾中TGFβ1蛋白的特征性表达提示，它们可由不同生精上皮细胞、间质细胞和附睾主细胞产生，可能以自分泌或旁分泌的形式作用于生殖细胞或间质细胞，直接或间接地影响精子的发生、发育和成熟过程，并与精子的活动和受精能力有关。关键词：转化生长因子β1；睾丸；附睾；免疫组化

转化生长因子β1（ransforming growth factor，TGFβ1）是一种多肽类物质，具有广泛多样的生物学作用，可调节细胞增殖、分化、黏附、迁移及凋亡，而且在胚胎发生、器官发育及免疫反应等方面也发挥重要作用；在雄性生殖系统中，TGFβ1具有促进细胞增殖与间质合成、调节细胞分化和睾丸间质细胞功能等重要作用［1］。本实验通过对TGFβ1在正常大鼠睾丸、附睾中表达定位的研究，探讨其在精子发生及成熟过程中的作用，为男性生殖生理学的研究提供实验资料。

1 材料与方法

1.1 动物与主要试剂

青春期健康雄性SD大鼠10只，鼠龄7～8周、体重180～210 g，购于西安交通大学医学院实验动物中心；兔抗人多克隆TGFβ1抗体、SP染色试剂盒等购自上海蓝基生物科技有限公司；DAB显色试剂盒购自北京中山金桥生物技术有限公司。

1.2 组织标本的采集与处理

手术摘取大鼠睾丸和附睾后，分离周围组织，立即投入Bouin＇s液固定并用细针穿扎睾丸，经梯度酒精脱水后二甲苯透明，石蜡包埋，组织切片厚度5 μm，用于免疫组化染色。

1.3 染色方法

按SP法常规操作程序进行免疫组化染色。组织标本经常规脱蜡，用3％双氧水室温孵育15 min，以封闭内源性过氧化物酶；在0.01 mol／L柠檬酸缓冲液（pH6.0）中煮沸10 min修复抗原；5％山羊血清封闭15 min，不洗，加一抗（1：100）4℃过夜；室温恢复40min后，滴加生物素标记的山羊抗兔IgG，37℃孵育60 min；加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，37℃孵育25 min；各步骤间用0.01 mol／L（pH 7.4）PBS洗2次，3 min／次，DAB显色3～5 min，终止反应；苏木精复染1～3 min，自来水返蓝20 min；常规逐级酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。用PBS代替一抗作为阴性对照，其余步骤相同。结果用Primo Star型数码光学显微镜观察并拍照，以组织中呈现棕黄色颗粒为阳性结果。

2 结果

2.1 睾丸中TGFβ1蛋白的表达

TGFβ1免疫反应阳性产物呈棕黄色颗粒，睾丸组织中生精上皮的精原细胞、精母细胞及各期精子细胞的胞质中TGFβ1呈弱阳性染色，在发育各阶段的顶体和精子残余体阳性表达较强；TGFβ1蛋白还分布于支持细胞的基部胞质及细胞侧面的胞质突内；睾丸间质细胞胞质呈TGFβ1强阳性表达（图1A）。

2.2 附睾中TGFβ1蛋白的表达

各段附睾管上皮中均有TGFβ1蛋白的表达，其表达具有细胞特异性和区域特异性。TGFβ1蛋白表达于附睾管上皮主细胞胞质中，阳性颗粒粗大，而且细胞游离面的纤毛也呈现阳性染色；但上皮中亮细胞、晕细胞及基细胞未见阳性表达；附睾管间结缔组织细胞及小血管有TGFβ1阳性表达，附睾尾部小管间肌细胞也呈TGFβ1表达阳性。TGFβ1在附睾各段的表达强弱具有差异性，以体部表达最强、尾部次之、头部较弱（图1B、C、D）。

图1 TGFβ1分别在青春期大鼠睾丸，附睾头、体、尾部免疫组化表达（SP×400）。

3 讨论

哺乳动物的生精过程不仅与神经内分泌调节有关，还受睾丸内许多重要的自分泌和旁分泌因子调节［2］。TGFβ1及其受体在哺乳动物睾丸中的表达具有种属特异性［3］，在睾丸的不同发育阶段其表达程度不同，并与生精上皮周期性变化有关。

本研究采用免疫组化法全面地检测了TGFβ1在青春期SD大鼠睾丸、附睾组织的表达、定位情况，发现TGFβ1蛋白在大鼠睾丸各级生精细胞及支持细胞中表达阳性，在各期精子细胞的顶体和精子残余体中表达较强，睾丸间质细胞胞质呈TGFβ1强阳性，与Yang［4］研究结果一致。TGFβ作为参与体内生理生化、信号转导与调控的重要因子，在调控细胞分化增殖、发育模式、形态发生等方面起着重要作用［5］，由此推测，TGFβ1可能参与精原细胞有丝分裂的增殖、分化及精母细胞的减数分裂过程，直接或间接地调控精子的发生。TGFβ1蛋白表达于各级精子细胞发育中的顶体内，说明其参与精子细胞的变态过程，直接参与精子的形成。顶体来源于高尔基复合体，可合成多种酶及顶体素，TGFβ1蛋白的表达伴随顶体发育的全过程，提示其对精子顶体的发育具有重要作用。有研究表明，TGFβs可能通过p38 MAPK信号途径以调节Sertoli细胞间的紧密连接，调控血－睾屏障的开启、闭合，进而控制精子发生中生精细胞向管腔运动［6］。TGFβ1主要促进间充质来源细胞的增殖和功能，明显抑制Leydig细胞间的通讯（GJIC），可抑制睾酮的分泌，抑制Leydig细胞增殖，参与细胞成熟分化过程的调控［1］，对睾丸发育及精子发生的起始和维持都有重要意义。因此TGFβ1可能作为睾丸间质细胞的局部调节因子，通过自分泌或旁分泌机制调控雄激素的分泌，并通过调控支持细胞与其他局部激素或有关因子相互作用，直接或间接地促进生殖细胞的增殖、分化与成熟，在维持、调节睾丸局部微环境及生精方面具有重要的生理意义。

附睾是精子转运、储存和成熟的器官，精子离开睾丸后，在经过附睾内不同节段的分泌蛋白进一步加工和修饰，逐渐成熟并获得运动能力及受精能力。主细胞是附睾上皮中的主要细胞，可合成和分泌多种特异成份以保证精子成熟和获得受精能力［7］，对精子成熟及维持管腔内微环境稳定起到调控作用。本研究结果提示大鼠附睾中，主细胞分泌大量的TGFβ1蛋白可能通过调节其自身的吸收和分泌功能，影响附睾管内分泌液的组成及精子成熟的微环境，参与睾丸后精子的成熟。附睾各区段的特异性表现在信号分子、转录子、调节蛋白及各种受体表达的独特性方面，形成了特异性的微环境，使附睾上皮在受到雄激素或其他信号因子的调控时，呈现不同的应答方式［8］，各段在精子成熟过程中起不同作用。TGFβ1在附睾头、体和尾部各段表达程度不同的分布格局可能与附睾区域特异的分泌和吸收功能有关，逐步促进精子的成熟。附睾管间结缔组织细胞、小血管、尾部小管间肌细胞也有TGFβ1阳性表达。TGFβ1可刺激肌样细胞生成和分泌胶原、蛋白多糖、黏连蛋白等，引起细胞外基质的增加，参与附睾微环境的调节。附睾间质血管和管周的肌细胞的TGFβ蛋白，可能通过调节微循环系统且以自分泌和旁分泌作用调节附睾内的微环境，参与附睾功能的维持。因此，推测附睾上皮中TGFβ1对附睾精子的进一步成熟及其功能获得起着重要作用。

总之，TGFβ1不仅可以通过调节睾丸及附睾的微循环，也可以自分泌或旁分泌方式直接作用于生殖细胞影响其增殖、分化和生精功能，并参与精子的睾丸后成熟过程，在男性生殖领域中占有重要地位，但其在生殖系统中的表达意义和调节机制还有待进一步研究。

［1］刘镘利，张志红，王宗仁，等.TGFβ1对大鼠睾丸Leydig细胞间连接蛋白43介导缝隙连接通讯功能的影响［J］.中华男科学杂志，2012，18（2）：99－104.

［2］彭弋峰，徐东亮，仲皖，等.大鼠血清表皮生长因子和睾丸表皮生长因子受体与精子生成的相关性［J］.生殖医学杂志，2003，12（2）：85－90.

［3］Wagener A，Fickel J，Schon J，et al.Seasonal variation in expression and localization of testicular transforming growth factors TGF－beta1 and TGF－beta3 correspondswith spermatogenic activity in roedeer［J］.J Endocrinol，2005，187（2）：205－215.

［4］Yang Xin，Ding Caifei，YAN Zhizhong，etal.EffectofWuzi Yanzong on Expression of TGF－β1 Signaling Pathway in Testis of Aspermatogenesis Rats［J］.Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine，2012，30（5）：1011－1013.

［5］田晓丽，杨杰.转化生长因子β研究进展［J］.解放军预防医学杂志，2006，24（2）：145－148.

［6］侯武刚，张远强，赵洁，等.转化生长因子及其受体在小鼠精子发生过程中的表达［J］.解剖学报，2006，37（2）：226－231.

［7］田宏，邱曙东，张秋养，等.附睾分泌蛋白－β1在青春期雄性大鼠睾丸和附睾中的表达［J］.中华男科学杂志，2006，12，（9）：780－783.

［8］魏金花，孙质健，马斌芳，等.受激活调节正常T细胞表达和分泌因子（RANTES）在小鼠附睾与精子的结合［J］.生殖与避孕，2012，32（6）：361－365.

Expression of TGFβ1in the testis and the epididym is of adolescentmale rats

AIQing-yan，ZHAO Yu-feng，YANG Jia-zhou，WANG Yan-mei，MIAO Nai-zhou
（Department of Human Histology and Embryology，Medical School of Yan＇an University，Yan＇an 716000，China）

Objective To study the expression of TGFβ1in the testis and the epididymis of adolescentmale rats and explore its function in themale reproductive system.MethodsThe expression of TGFβ1was detected in the testis and the epididymis of 10 adolescent SD rats by the SP immunohistochemicalmethod.Results TGFβ1protein was specifically present in the testis and the epididymis.In the testis，TGFβ1immunoreactive particleswere localized in the cytoplasm of spermatogenic cells，forming acrosome of spermatids，Sertoli cells and Leydig cells.In the epididymis，TGFβ1immunonreaction was observed in the principle cells of whole epididymal epithelium，but not detected in the clear cell，halo cell and basal cell.ConclusionSpecific expression patterns of TGFβ1in the testis and epididymis of rats suggest that they may be produced by various seminaferous epithelium cells，mesenchymal cells and Epididymal principal cells.They possibly act on the germ cells of the testis and the leydig cells in an autocrine or paracrine way.Meanwhile，theymay directly or indirectly affect the process of the spermatogenesis and spermiotelcosis.In addition，they have some connection with the sperm motility and fertility.

TGFβ1；Testis；epididymis；Immunocytochemistry

R363

A

1672－2639（2014）01－0001－03

2013－07－18；责任编辑 赵菊梅］

国家级大学生创新训练计划项目（201310719010），省级大学生创新创业训练计划项目（201310719021），延安大学专项基金（YD2012－01）