患病牦牛源大肠杆菌对10种不同抗菌药物敏感性试验

陈朝喜, 张郁, 西格基

(1.西南民族大学生命科学与技术学院, 四川 成都 610041; 2.黑水县畜牧兽医局, 四川 阿坝 623500)

患病牦牛源大肠杆菌对10种不同抗菌药物敏感性试验

陈朝喜1#, 张郁1#, 西格基2

(1.西南民族大学生命科学与技术学院, 四川 成都 610041; 2.黑水县畜牧兽医局, 四川 阿坝 623500)

采用K-B纸片扩散法对67株患病牦牛源大肠杆菌进行粘杆菌素、多西环素、利福平等10种不同抗菌药物敏感性试验, 试验数据采用Whonet5.4软件统计以分析牦牛源大肠杆菌的耐药率和耐药谱型. 结果表明, 牦牛源大肠杆菌对乙酰甲喹的耐药率为41.79%, 其余9个药的耐药率均在80%以上, 其中利福平、土霉素的耐药率为100%. 耐药谱型以粘杆菌素/多西环素/利福平/磺胺嘧啶/替米考星/土霉素/萘啶酸/磺胺间甲嘧啶/磺胺二甲嘧啶为优势耐药谱型.

牦牛; 大肠杆菌; 耐药率; 耐药谱型

牦牛大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌(埃希氏大肠杆菌)引起的一种急性传染病, 是目前危害牦牛生产的主要疾病之一[1]. 该病既是原发性疾病又可继发多种疾病, 具有较高的发病率和死亡率[2]. 该病在牧区普遍存在,给牦牛业带来了不容忽视的经济损失. 抗菌药物的应用为动物生产和疾病的防治提供了极大的便利, 因此在畜牧业上得到了广泛的应用, 为我国畜牧业发展做出了很大的贡献. 但是随着抗菌药物的大量使用和不合理应用,细菌耐药性问题也越来越严重. 为调查大肠杆菌耐药性流行和发展现状, 本研究于2012年11月在成都市青白江区某牦牛屠宰场和阿坝州红原县、松潘县和茂县等采集的患病牦牛病料,分离得到67株大肠杆菌, 对其进行了常规的大肠杆菌的分离鉴定并运用K-B纸片扩散法, 检测了分离的大肠杆菌对10种不同抗菌药物的耐药情况, 确定其对抗菌药物的敏感性, 找到牦牛源大肠杆菌的优势耐药谱型. 为指导兽医临床合理用药、科学选择药物, 还可以为耐药性相关研究提供材料和依据.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样本

137个样本于2012年11月在成都市青白江区某牦牛屠宰场和阿坝州红原县、松潘县和茂县采集, 其中包括牦牛粪便、尿液及土壤样本. 用棉拭子蘸取牦牛刚排出的粪便、尿液, 将蘸有粪便的棉拭子迅速放入提前配臵好装有LB肉汤的灭菌塑料管内, 盖上塞子. 土壤样本直接从屠宰场周围采集.

1.1.2 药物

粘杆菌素(Pmb), 多西环素(Dox), 利福平(Rif), 磺胺嘧啶(SD-Na), 替米考星(Til), 乙酰甲喹(Meq), 土霉素(Otc), 萘啶酸(Nac), 磺胺间甲嘧啶(SMM), 磺胺二甲嘧啶(SM2)共10种抗菌药物原料药粉均由成都中牧药业股份有限责任公司提供, 所有药物临用前均配成5120μg/mL的母液备用.

1.2 方法

1.2.1 大肠杆菌的分离和鉴定

方法[3]对采集样本进行增菌培养. 选取玫瑰红色、湿润、边缘整齐、大小适中的单个菌落进行革兰氏染色鉴定, 光学显微镜下观察大肠杆菌为红色、中等大小、两端钝圆的短杆状菌体.

1.2.2 药敏片的制作

取质量较好的定量滤纸, 用普通打孔器打成直径6mm的圆形小纸片, 取一定数量纸片放入配好的药液中,同时记录药物名称, 臵于37℃培养箱中过夜; 24h后观察小瓶中的液体是否浑浊, 若浑浊说明药液被污染, 则弃去不用; 若不浑浊则用注射器吸干药液. 臵于37℃培养箱中使其完全干燥. 干燥后取出放入4℃的冰箱中保存[4].

1.2.3 药敏试验及结果处理

采用K-B纸片扩散法进行药物敏感性试验, 测量抑菌圈(直径)的大小, 按照美国实验室标准委员会(NCCLS)药敏试验纸片扩散法标准进行判定, 试验数据采用Whonet5.4软件进行统计分析.

2 结果分析

2.1 大肠杆菌的分离和鉴定

从97份病料中共分离纯化得到67株可疑大肠杆菌, 经革兰氏染色和生化鉴定确定为大肠杆菌, 确定其分离率为69.07%.

2.2 药敏试验结果及耐药性结果

利用Whonet5.4软件对10种药物的药敏试验结果进行数据处理, 67株大肠杆菌对10种抗菌药物的抑菌圈大小情况和耐药性分析结果分别见表1和见图1. 从中可以看出: 分离的患病牦牛源大肠杆菌对受试药物的耐药率较高, 除了乙酰甲喹的耐药率为41.79 %, 其他药物的耐药率均达到80%以上, 而利福平、土霉素的耐药率达到100%.

表1 患病牦牛源大肠杆菌对10种抗菌药物的耐药率汇总

2.3 大肠杆菌耐药谱型分析

利用Whonet5.4软件分析67株大肠杆菌对10种药物存在19种不同耐药谱型, 其中以粘杆菌素/多西环素/利福平/磺胺嘧啶/替米考星/土霉素/萘啶酸/磺胺间甲嘧啶/磺胺二甲嘧啶为优势耐药谱型, 耐药谱型分析见表2.

3 分析与讨论

3.1 患病牦牛源大肠杆菌的耐药性

抗生素在养殖业中进行预防性用药可对疾病的预防和控制产生一定的效果, 同时也导致了滥用药物而带来的细菌耐药性问题. 本试验67株大肠杆菌中, 牦牛源大肠杆菌除对乙酰甲喹的耐药率较低外, 对其它药物的耐药率均较高, 利福平、土霉素甚至达到完全耐药. 通过耐药谱型的分析发现, 牦牛源大肠杆菌的耐药谱型均超过5种药物, 出现了多重耐药的现象. 相关研究表明有病乱投药是大肠杆菌容易产生耐药性的自身原因[5].

图1 患病牦牛源大肠杆菌对10种抗菌药物的耐药性分析

表2 67株患病牦牛源大肠杆菌对10种抗菌药物的耐药谱型

3.2 患病牦牛大肠杆菌耐药原因分析及对策

本研究结果显示, 分离菌株表现出多重耐药现象, 可能与临床的不合理用药和长期用药有关. 与我们前期的试验结果相比, 本年度分离的大肠杆菌和沙门氏菌的耐药率均比前期较高[6-7]. 同时, 因为本研究分离菌株的目的为后续探讨耐药基因和毒力因子相关性提供材料, 因此在采样过程中我们主要针对患病牦牛及其生活环境,这也可能是试验结果耐药率偏高的一个原因. 但通过本实验可以为临床患病牦牛的防治和抗菌药物的合理使用提供一定的指导, 避免盲目选用药物造成耐药性的蔓延和疾病的迁延不愈, 间接增加养殖成本.

参考文献:

[1] 汪洋, 易力, 王红宁, 等. 川西北牦牛致病性大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 中国兽医杂志, 2008, 44(5): 36-37.

[2] 陈明勇, 张冰, 陈德威, 等. 西藏地区牦牛致病性大肠杆菌的分离鉴定[J]. 中国预防兽医学报, 2001, 23(5): 389-390.

[3] 陈朝喜, 朱恒乾, 廖晓萍, 等. 大肠埃希菌耐药谱型、基因型和生物膜表型关系研究[J]. 动物医学展, 2011, 32(4): 59-62.

[4] 谭瑶, 赵清, 舒为群, 等. K-B纸片扩散法药敏试验[J]. 检验医学与临床, 2010, 7(20): 2290-2291.

[5] 张秀英, 卢秀梅. 大肠杆菌对兽医临床抗菌药物耐药情况分析[J]. 河北畜牧兽医, 2003, 19(5): 15-19.

[6] 陈朝喜, 杜雄伟, 师志海. 不同来源沙门氏菌的分离鉴定及其耐药谱型比较[J]. 湖北农业科学, 2012, 51(21): 4834-4836.

[7] 师志海, 王文佳, 兰亚莉, 等. 宠物源性大肠杆菌耐药性调查[J]. 中国畜牧兽医, 2012, 39(7): 223-224.

Drug sensitivity tests of Escherichia coli isolated from sick yak to ten different antibacterial drugs

CHEN Chao-xi1, ZHANG Yu1, XI Ge-ji2
(1. School of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.; 2. Animal Husbandry and Veterinary Bureau of Heishui County, Aba 623500, P.R.C.)

K-B disc diffusion test method and Whonet5.4 software are used for antimicrobial susceptibility testing of 67 strainsEscherichia colito 10 different antibacterial agents such as Colistin, Doxycycline and Rifampicin, and drug resistance rate and drug resistance spectrum analysis are conducted. The results show that drug resistant rate for Mequindox is 41.79%, and resistant rates of the other nine drugs are more than 80%, for Rifampicin and Oxytetracycline the drug resistance rates are 100%. The predominant drug resistance spectrum is Pmb/Dox/Rif/SD-Na/Til/Otc/Nac/SMM/SM2.

yak;Escherichia coli; drug resistant rate; drug resistance spectrum

S859

A

1003-4271(2014)01-0020-04

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.01.04

2013-12-06

陈朝喜(1980-), 男, 博士, 副教授, 主要从事兽药残留及细菌耐药机制研究. #为同等贡献作者.

西格基(1971-), 男, 藏族, 兽医师.