江西省产黄酒中氨基甲酸乙酯残留量的GC-MS分析

宋利军，杨竹，周银古*，李腾根，刘瑞弘，毛尚根，刘芳宇，李彪

（1.新余市疾病预防控制中心，江西新余338025；2.新余市渝水区疾病预防控制中心，江西新余338025）

江西省产黄酒中氨基甲酸乙酯残留量的GC-MS分析

宋利军1，杨竹2，周银古1*，李腾根1，刘瑞弘1，毛尚根1，刘芳宇1，李彪1

（1.新余市疾病预防控制中心，江西新余338025；2.新余市渝水区疾病预防控制中心，江西新余338025）

采用气相色谱-质谱法调查60份江西省内生产的黄酒产品中氨基甲酸乙酯（EC）残留量。酒样添加d5-EC同位素内标，经硅藻土层析住吸附，乙醚洗脱，用GC-MS测定，内标法定量。色谱柱为DB-INNOWAX石英毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm）。加标回收试验的平均回收率为107.5%，相对标准偏差为1.33%（n=2），黄酒中EC的污染水平中，EC的中位数为24.4μg/kg，均值为35.0μg/kg，检出率为70%，含量值范围为6.0～123.7μg/L。通过此次调查江西产黄酒中氨基甲酸乙酯残留量，将为我国制定国家标准和对黄酒中氨基甲酸乙酯的污染水平评估提供数据支持。

气相色谱-质谱法；黄酒；氨基甲酸乙酯

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamagte，EC）是一种可以引起癌变的物质，当氨基甲酸乙酯摄入过量或累积过量，都会引起动物体内脱气核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）中多位点发生碱基突变、移位，从而导致癌变的发生。氨基甲酸乙酯引起癌变的组织或器官主要有：肺、淋巴结、肝和皮肤等。1985年，多位学者研究证实饮料酒中含有的EC具有致癌作用[1-3]，引起世界卫生组织（world health organization，WHO）和各个国家的重视。氨基甲酸酯类中的甲酯不具有致癌作用，而乙酯、丙酯和丁酯都具有致癌作用，其中，危害性较强的是乙酯[4]。2007年2月，在里昂举行的WHO的国际癌症研究机构（international agency for research on cancer，IARC）专家会议上，正式将氨基甲酸乙酯从2B类致癌物提高为2A类致癌物——“很可能对人类有致癌作用”[5]。肝细胞瘤的发生与氨基甲酸乙酯的含量呈线性关联，主要原因是N6-末端脱氧核苷酸随着DNA复制而不断的形成[6]。气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法是用气相色谱法分离并定性与用质谱法定性相联用的一种分析方法。其主要用于检测痕量的化合物。本研究主要采用GC-MS法对60份江西省内生产的黄酒产品中氨基甲酸乙酯残留量进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

60份样本均来自江西省内生产企业。采样要求依据《2012年国家食品污染和有害因素风险》工作手册进行，所有样本都抽取2份，其中一份用于检测，另一份作为留样，以备复检。所采集的样本严格按照工作手册要求记录产品名称、产品批号、产地等样本信息。

1.1.2 试剂

无水乙醚（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、CLE-硅藻土固相萃取柱（ExtrelutTM20）。标准品EC（分子质量89.09，纯度> 98.0%，批号51-79-6）：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；d5-EC（分子质量94.13，纯度≥98.0%，批号73962-07-9）：上海普迈生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

GCMS-QP2010plus气质联用仪：日本SHIMADZU公司；N-EVAPTM 111氮吹仪：美国Organ-omation Associates公司；UVS-1涡旋混匀器：美国Thermo公司；HSE-120固相萃取仪：上海禾工科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理方法

（1）试样制备

称取2.0g（准确至0.01g）酒样于10mL比色管中，加100μL d5-氨基甲酸乙酯内标使用液（1.0μg/mL），涡旋混匀。

（2）试样净化

将添加了内标的试样加到层析柱中，打开活塞，放置30min。用15mL乙醚洗脱，收集洗脱液于10mL具塞刻度试管中，30℃以下用氮气缓缓吹至少于1mL，加少量甲醇继续吹至0.5mL左右，加甲醇定容至1.0mL，涡旋混匀，静置，取上清液供GC/MS分析。

1.3.2 标准溶液配制

内标溶液：准确称取（精确至0.1mg）适量的d5-EC标准品，用甲醇配制成质量浓度为1.0mg/mL的标准储备液，使用时用甲醇稀释至1.0μg/mL。

EC标准溶液：准确称取（精确至0.1mg）适量的EC标准品，用甲醇配制成质量浓度为1.0mg/mL的标准储备液，使用时用甲醇稀释至0.2μg/mL。

标准系列溶液：准确吸取0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、0.2μg/mL的EC标准使用液，各加100μL、1.0μg/mL d5-EC使用液（1.0μg/mL），用甲醇定容至1.0mL，得到质量浓度为20.0ng/mL、40.0ng/mL、80.0ng/mL、120ng/mL、160ng/mL的标准系列溶液（d5-EC质量浓度均为100.0ng/mL）。

1.3.3 仪器分析

（1）色谱条件

色谱柱：DB-INNOWAX，30m×0.25mm×0.25μm；载气（氦气）流速：1.0mL/min，恒流；吹扫流速：3.0mL/min；进样口温度：250℃；柱温程序：初温50℃，保持0.5min，然后以5℃/min升至150℃，以40℃/min升至220℃保持3min；进样量：1.0μL；无分流进样。电离方式：电子电离（electron ionization，EI）源。离子源温度：230℃。氨基甲酸乙酯选择监测离子（m/z）：45、62、74；定量离子62。d5-氨基甲酸乙酯选择监测离子（m/z）：50、64、76；定量离子64。

（2）测定

采用自动进样器进样，在相同的气相色谱条件下，分别将标准系列和试样溶液进行气相色谱质谱分析，以保留时间和各监测离子的丰度比定性，内标法定量。以各系列标准溶液的质量浓度（ng/mL）与定量离子峰面积比（m/z 62与m/z 64）绘制标准曲线。根据标准曲线计算测试液中氨基甲酸乙酯含量。试剂空白、样品本底、样品加标和标准序列均在同一仪器条件下进行测定。

1.3.4 数据处理

所得数据采用EXCEL2003进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制及样本的GC/MS图

通过对标准系列进行气相色谱质谱分析，以浓度为横坐标x，峰面积为纵坐标y，绘制标准曲线见图1，回归方程为y=1.845x+0.000，相关系数r2=0.999 9。此外，列出了样本序号分别为45和54 2种样品的总离子色普分别见图2、图3。

图1 氨基甲酸乙酯的标准曲线Fig.1 Standard curve of ethyl carbamate

图2 序号为45的瑞田老酒中氨基甲酸乙酯含量的总离子色谱图Fig.2 Total ion chromatogram of ethyl carbamate content in No.45 Tianrui wine

图3 序号为54的井冈山五年红米酒中氨基甲酸乙酯含量的总离子色谱图Fig.3 Total ion chromatogram of ethyl carbamate content in No.54 Jinggangshan red rice wine

2.2 加标回收试验分析

为了考察本方法的灵敏度、准确度和精密度，对黄酒样品添加了d5-氨基甲酸乙酯的回收试验，结果见表1。由表1可知，回收率为107.5%，相对标准偏差（relative staudard deviation，RSD）为1.33%。本方法满足黄酒中氨基甲酸乙酯残留量的检测要求，并且此结果与吕芬的研究结果一致[7]。该方法测定氨基甲酸乙酯的准确度和精密度良好，能满足痕量分析的要求。

表1 加标回收试验结果(n=2)Table 1 Result of recovery standard addition

2.3 江西产黄酒中氨基甲酸乙酯含量的GC/MS分析

对60份江西产黄酒中氨基甲酸乙酯含量测定，结果见表2。由表2可知，黄酒中EC的污染水平中，EC的中位数为24.4μg/kg，均值为35.0μg/kg。

所有黄酒产品EC检测结果见表3。由表3可知，氨基甲酸乙酯检出42份，检出率为70%（42/60），含量范围为6.0μg/kg～123.7μg/kg，具体残留量。

表2 黄酒中EC的污染水平Table 2 Pollution levels of ethyl carbamate in rice wine

表3 黄酒的EC检测结果Table 3 Monitoring results of rice wine

2.3.1 产品批号分析

从表3可以得知，所有样本的生产批号为2010年至2012年之间。其中，未检出的18份样本，其生产批号在这个期间内，与其他产品批号之间并无差异。因此，样本的氨基甲酸乙酯含量与生产批号无关。

2.3.2 产品产地分析

从表3中可以得知，样本产地来源于南昌市的有18个，其中未检出的样本有7个，未检出率为38.9%；样本产地来源于抚州市的有8个，其中未检出的样本有3个，未检出率为37.5%；样本产地来源于吉安市的有10个，其中未检出的样本有3个，未检出率为30.0%；样本产地来源于井冈山市的有5个；样本产地来源于九江市、萍乡市的各有1个，其中未检出的样本各有1个，未检出率为100%；样本产地来源于樟树市的有6个，其中未检出的样本有3个，未检出率为50.0%；样本产地来源于新余市的有6个，未检出率为0%；样本产地来源于宜春市的有5个，未检出率为0%。从地域分布看，南昌市、九江市、萍乡市、抚州市和吉安市分别位于江西省的东南西北4个方位，分别与湖南省、湖北省和福建省接近，这些省的经济发展比较快，会促进邻省地市的经济发展。而新余、宜春处于江西的中部，经济发展相对会受到一定影响。地域的差异会影响到当地生产企业的生产规模、生产工艺等，从而影响黄酒的品质，造成黄酒中氨基甲酸乙酯的含量不同。

2.4 氨基甲酸乙酯分析

2.4.1 氨基甲酸乙酯的限量分析

1985年，加拿大的卫生与福利组织（canadian depart mentof healthandwelfare，CDHW）首先规定了各类酒中的EC限量，随后多国也制定了限量条例[8-10]。关于黄酒中氨基甲酸乙酯的限量，国际上尚无统一的标准[11-12]。目前，我国尚无黄酒中氨基甲酸乙酯的标准，制定相关的标准已非常重要。

2.4.2 氨基甲酸乙酯的危害及降解分析

氨基甲酸乙酯主要在煎酒和贮酒过程中形成，煎酒温度高，能提高黄酒的稳定性，但随煎酒温度的升高和煎酒时间的延长，酒液中的尿素和乙醇会加速形成更多的氨基甲酸乙酯[13]。黄酒中EC具有致癌的特点会对人们的身体健康造成一定的负面影响。LUSTER M I等[14]对5～7周的雌性杂交小鼠饲喂不同剂量的氨基甲酸乙酯，观察其免疫功能的变化，结果显示，在不同剂量的氨基甲酸乙酯作用下，引起了严重骨髓抑制，而对体液免疫、细胞免疫和巨噬细胞的功能影响较少。为了降低黄酒中的氨基甲酸乙酯残留量，可通过适当地控制发酵条件降低酒中胺类化合物的含量，或向完成发酵的酒中添加酸性尿酶等措施[15]。

3 结论

本次检测的江西产60份黄酒样本中，EC的中位数为24.4μg/kg，均值为35.0μg/kg，参照国际标准（EC含量≤20μg/L）[16]，低于国际标准值的有35份（占58.33%），高于国际标准值的有25份（占41.67%），这表明，生产工艺和生产条件等的限制，使得国内部分黄酒中的氨基甲酸乙酯残留量处于比较高的水平。通过分析黄酒中的氨基甲酸乙酯残留量，可以为我国制定国家标准和对黄酒中氨基甲酸乙酯的污染水平评估提供数据支持，并且通过进一步对降低黄酒中氨基甲酸乙酯的含量进行深入研究，更加有利于确保酒精饮料的安全。

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Determination of ethyl carbamate residue in Jiangxi rice wine by GC-MS

SONG Lijun1,YANG Zhu2,ZHOU Yingu1*,LI Tenggen1,LIU Ruihong1,MAO Shanggen1,LIU Fangyu1,LI Biao1
(1.Xinyu City Center for Disease Control and Prevention,Xinyu 338025;2 Xinyu City Yushui District Center for Disease Control and Prevention,Xinyu 338025,China)

The ethyl carbamate(EC)content of 60 wine samples produced by Jiangxi province was detected by GC-MS.The sample was added with ethyl carbamate-d5(D5-EC),then absorbed into a column of extrelut and eluted with ethyl ether,separated by GC-MS on a DB-INNOWAX capillary column(30m×0.25mm×0.25μm)and quantified by internal standard method.The result show that the average recovery and the relative standard deviation of EC content were 107.5%and 1.33%(n=2),respectively.The median value of EC content was 24.4 μg/kg and average value was 35.0 μg/kg in rice wine EC pollution levels.Within the 60 samples,the positive detection rate of EC content was 70%,and the EC content were between 6.0-123.7 μg/L.Through the survey of EC residue content of rice wine produced by Jiangxi,it would provide data support to draw up the national standards and assess the EC pollution levels of wine for China.

GC-MS;rice wine;ethyl carbamate

TS262.4

A

0254-5071（2014）03-0147-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.035

2013-12-29

新余市科技计划项目（20123090851）

宋利军（1984-），男，硕士，主要从事国家食品安全风险监测工作。

*通讯作者：周银古（1968-），男，高级技师，本科，主要从事理化检验工作。