枯草芽孢杆菌C3产抗菌物质发酵条件优化

杨永青，谢远红，张红星，熊利霞，马晓丹，刘慧*，孔保华

（1.北京农学院食品科学与工程学院，北京102206；2.农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室，食品质量与安全北京实验室，北京102206；3.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030）

枯草芽孢杆菌C3产抗菌物质发酵条件优化

杨永青1，2，谢远红1，2，张红星1，2，熊利霞1，2，马晓丹1，2，刘慧1，2*，孔保华3

（1.北京农学院食品科学与工程学院，北京102206；2.农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室，食品质量与安全北京实验室，北京102206；3.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030）

利用筛选的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）C3研究提高产抗菌物质的发酵条件。通过测定枯草芽孢杆菌C3抗菌物质对黑曲霉孢子萌发的抑制率，设计6因素3水平正交试验得到优化的发酵条件为：种子液的菌龄12h，种子液接种量2%，发酵培养基装液量75mL/250mL，发酵培养基初始pH 7.0，发酵温度37℃，发酵时间48h。在优化发酵条件下，枯草芽孢杆菌C3产抗菌物质的抑菌活性比优化前提高了26.52%。

枯草芽孢杆菌；抗菌物质；发酵条件优化

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种公认安全的有益微生物，对人畜无毒害，不污染环境，其在生长和代谢过程中能产生包括肽类、脂肽类、多烯类、磷脂类、氨基酸类与核酸类等多种抗菌物质，可以抑制霉菌、酵母菌、细菌、病毒等多种微生物的生长，在果蔬保鲜、果实采后病害、植物病害的生物防治方面具有重要应用价值[1-2]。张丽丽等[3]通过试验证明，枯草芽孢杆菌Sf-19培养原液对梨轮纹病菌菌丝生长的平板抑制率为87.33%，孢子萌发的抑制率为97%；黄曦等[4]研究发现，枯草芽孢杆菌ON-6菌株能抑制荔枝炭疽菌的生长；李永刚等[5]研究发现，枯草芽孢杆菌BS2对葡萄灰霉病菌具有较好的拮抗作用；杨琦瑶等[6]报道枯草芽孢杆菌B006对黄瓜枯萎病菌和辣椒疫霉病菌具有一定抑制作用。枯草芽孢杆菌抗菌物质具有较广谱的抗菌作用，通过优化其发酵培养基和发酵条件，提供最适的生长环境，可以提高抗菌物质的产量与抑菌活性[7-9]。课题组前期试验优化了枯草芽孢杆菌C3产抗菌物质的发酵培养基，对黑曲霉孢子萌发的抑制率提高了118.64%[10]。继而课题组采用6因素3水平正交试验优化产抗菌物质的发酵条件，以抑制率评价C3菌株抗菌物质对黑曲霉孢子萌发的抑制活性，旨在提高C3菌株抗菌物质的产量，以便后续分离纯化抗菌物质，为进一步研究其抑菌机理及果蔬保鲜应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

指示菌株：黑曲霉（Aspergillus niger），由食品质量与安全北京实验室保藏并提供。

试验菌株：枯草芽孢杆菌C3，由食品质量与安全北京实验室课题组筛选并保存，经微量生化反应与16s DNA方法鉴定为Bacillus subtilis。

1.1.2 培养基

发酵培养基[10]：葡萄糖1.0%，蛋白胨1.5%，酵母浸粉1.5%，KH2PO40.1%，NaCl 0.5%，MgSO4·7H2O 0.15%；pH 7.0，0.1MPa高压灭菌15min。

种子液培养基[11]：葡萄糖1.0%，蛋白胨1.0%，NaCl1.0%，KH2PO40.15%，MgSO4·7H2O 0.15%，pH 7.0。

指示菌斜面培养基采用马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基[12]：马铃薯（去皮切块）200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1 000mL，pH自然。

菌落计数培养基：PDA培养基内加入0.1%吐温-80，以及终质量浓度为30.0μg/mL青霉素与链霉素混合液（青霉素与链霉素的质量比为1∶1）[13]。

1.2 仪器与设备

MLS-3750型全自动高压蒸汽灭菌锅：日本SANYO公司；THZ-C-1型台式冷冻恒温振荡器：太仓市实验设备厂；BS224S型电子天平：德国赛多利斯集团；GHP-9160型恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；BCN-1360B型无菌超净工作台：哈尔滨东联电子技术开发有限公司；PHS-3B型雷磁便携式酸度计：上海精科实业有限公司；0.22μm无菌过滤器：德国赛多利斯集团。

1.3 方法

1.3.1 指示菌悬液制备

无菌超净台中将黑曲霉接种于PDA斜面培养基中，28℃培养48h后，用灭菌生理盐水洗脱孢子，经4层灭菌纱布过滤得黑曲霉孢子悬液。将黑曲霉孢子悬液按10倍梯度稀释法制成10-2～10-6梯度黑曲霉孢子稀释液，4℃冰箱内保存备用。

1.3.2 抗菌物质粗提液制备

枯草芽孢杆菌C3发酵液4℃10 000r/min离心15min，弃菌体取上清液，用0.22μm细菌过滤器过滤即得到无菌抗菌物质粗提液。

1.3.3 抗菌物质活性的测定

抗菌活性的测定采用菌落计数法[14]。先吸取10-3～10-4浓度黑曲霉孢子稀释液0.1mL加入菌落计数培养基平板中，涂匀涂布，静置10min，再取0.1mL抗菌物质粗提液均匀涂布于上述培养基，静置10min后，28℃培养24～48h，计数霉菌孢子萌发为菌落的数量，根据孢子萌发的数量评价抗菌物质的活性。

霉菌孢子萌发抑制率的计算公式：

1.3.4 发酵条件优化正交试验

根据李凛等[16-19]的研究文献及单因素预试验结果，选取种子液菌龄、接种量、装液量、初始pH值、发酵温度、发酵时间6个影响因素，设计6因素3水平L18（36）正交试验，如表1所示。根据正交试验表分别进行发酵试验，发酵结束后调节发酵液pH至7.0，测定抗菌物质活性。

表1 发酵条件正交试验设计因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test for fermentation condition optimization

1.3.5 发酵条件优化正交试验验证

根据正交试验优化结果，选择适宜的菌龄、接种量、装液量、初始pH值、温度及发酵时间组合为处理组，对枯草芽孢杆菌产生抗菌物质的效果进行验证。对照组采用优化前的发酵条件，按1.3.2方法测定抗菌物质活性，同时计算霉菌孢子萌发抑制率。

2 结果与分析

2.1 发酵条件优化正交试验

发酵条件对抗菌物质产量影响优化正交试验结果见表2，正交试验结果方差分析见表3。

表2 发酵条件优化的正交试验结果Table 2 Results of orthogonal test for fermentation condition optimization

表3 发酵条件优化的方差分析Table 3 Variance analysis of fermentation conditions optimization

2.1.1 种子液菌龄对抗菌物质产量的影响

微生物产生的代谢产物大多在对数生长期或稳定期合成，因此采用对数生长期的种子液进行接种发酵，有助于缩短生长曲线的迟缓期，并尽快进入对数生长期。枯草芽孢杆菌的抗菌物质主要在对数生长末期、尚未进入稳定期时合成。陈雪等[20]研究细菌素的产量与枯草芽孢杆菌生长曲线间的关系，发现细菌素主要在对数生长期合成。由表2可知，采用不同菌龄的种子液接种发酵培养基时，枯草芽孢杆菌C3对黑曲霉的抑制活性影响表现为kA3＞kA1＞kA2，即接种发酵培养基的种子液菌龄为12h时抑菌活性最强，6h次之，9h最小。由此表明种子液菌龄为12h时，正是菌体处于对数生长期的时间，故确定种子液的较优菌龄为12h。由表3方差分析可知，采用不同菌龄的种子液接种发酵，对抗菌物质的抑菌活性影响极显著（α=0.01）。

2.1.2 接种量对抗菌物质产量的影响

在一定范围内，较大的接种量更有利于微生物快速进入对数生长期或稳定期，但带入培养基的代谢废物亦增多，不利于微生物的生长代谢，进而影响抗菌物质的产量。由表2可知，采用不同接种量时，枯草芽孢杆菌C3对黑曲霉的抑制活性表现为kB2＞kB3＞kB1，即接种量为2%时抗菌物质产量最高，接种量为3%时次之，接种量为1%最低。故确定种子液的较优接种量为2%。由表3方差分析可知，不同种子液的接种量对抗菌物质的抑菌活性影响显著（α=0.05）。

2.1.3 装液量对抗菌物质产量的影响

枯草芽孢杆菌为好氧微生物，故充足的氧气有利于其生长代谢。装液量的多少决定发酵时的通气量。同时，充足的营养物质有利于枯草芽孢杆菌的快速繁殖，增加产抗菌物质的活菌基数。因此，在一定范围内调整装液量比例，可提高枯草芽孢杆菌抗菌物质的合成与积累。由表2可知，采用不同装液量时，枯草芽孢杆菌C3对黑曲霉的抑制活性表现为kC3＞kC2＞kC1，即装液量为75mL/250mL时抗菌物质产量最高，50mL/250mL时次之，25mL/250mL时最低。结果表明，装液量为75mL/250mL时通气量充足，同时营养物质与通气量二者对枯草芽孢杆菌抗菌物质产量的影响达到最佳平衡点，此时抗菌物质产量最高。故确定发酵培养基的装液量为75mL/250mL。由表3方差分析可知，不同发酵培养基的装液量对抗菌物质的抑菌活性影响显著（α=0.05）。

2.1.4 初始pH值对抗菌物质产量的影响

适当的初始pH值有利于微生物的生长及代谢产物的积累。由表2可知，采用不同发酵培养基初始pH值时，枯草芽孢杆菌C3对黑曲霉的抑制活性表现为kD2＞kD1＞kD3，即初始pH值为7.0时抗菌物质产量最高，pH5.0时次之，pH9.0时最低。这与刘永峰等[21]优化枯草芽孢杆菌B916产抗菌物质发酵条件时的结果一致。故确定发酵培养基的较优初始pH值为7.0。由表3方差分析可知，不同发酵培养基初始pH值对抗菌物质的抑菌活性影响极显著（α=0.01）。

2.1.5 发酵温度对抗菌物质产量的影响

温度是影响微生物生长繁殖最重要的物理因素，适宜的发酵温度有利于枯草芽孢杆菌抗菌物质的合成与积累。由表2可知，采用不同发酵温度时，枯草芽孢杆菌C3对黑曲霉的抑制活性为kE2＞kE1＞kE3，即37℃时抗菌物质产量最高，34℃时次之，40℃时最低。故确定37℃为较优的发酵温度。由表3方差分析可知，不同发酵温度对抗菌物质的抑菌活性无显著影响。

2.1.6 发酵时间对抗菌物质产量的影响

微生物代谢产物的积累是一个复杂的动态过程，在不同发酵时间积累的代谢产物各不相同；同时，不同代谢产物出现的最大积累量的时间亦不同。在发酵过程的某一时刻，目的代谢产物会有最大的积累量。由表2可知，采用不同发酵时间时，枯草芽孢杆菌C3对黑曲霉的抑制活性表现为kF2＞kF1＞kF3，即发酵时间为48h时抗菌物质产量最高，24h时次之，72h时最低。故确定48h为较优的发酵时间。由表3方差分析可知，不同发酵时间对抗菌物质的抑菌活性影响显著（α=0.05）。

由表2中极差R值分析可知，以枯草芽孢杆菌拮抗霉菌孢子萌发生长的黑曲霉菌落数为指标，则RA（菌龄）＞RD（初始pH值）＞RC（装液量）＞RF（时间）＞RB（接种量）＞RE（温度），又由表3方差分析可知，菌龄、接种量、装液量、初始pH值、时间对枯草芽孢杆菌抗菌物质产量均有显著影响（α=0.05），其中种子液菌龄和发酵培养基初始pH值对枯草芽孢杆菌抗菌物质产量有极显著影响（α=0.01），即菌龄影响最显著，其次是初始pH值、装液量、发酵时间、接种量，影响最小的是发酵温度。枯草芽孢杆菌产抗菌物质发酵条件的最优组合为A3B2C3D2E2F2，即种子液菌龄12h，种子液接种量2%，发酵培养基装液量75mL/250mL，发酵培养基初始pH 7.0，发酵温度37℃，发酵时间48h。

2.2 发酵条件优化正交试验验证

表4 发酵条件优化前后的结果对比Table 4 Comparison of fermentation result before and after optimization

由表4可知，采用优化组合条件对枯草芽孢杆菌进行发酵，所产抗菌物质可将黑曲霉孢子萌发数量由未优化前的6.90×106CFU/mL降低至优化后的5.07×106CFU/mL，对黑曲霉的抑制率提高了26.52%，抗菌活性明显提高，表明采用优化发酵条件可以较大增加枯草芽孢杆菌抗菌物质的产量。

3 结论

不同发酵条件对枯草芽孢杆菌C3抗菌物质的产量有明显影响。其中种子液菌龄和发酵培养基初始pH对枯草芽孢杆菌C3抗菌物质产量影响极显著（α=0.01），接种量、装液量、发酵时间对枯草芽孢杆菌C3抗菌物质产量影响显著（α=0.05），而发酵温度对枯草芽孢杆菌C3抗菌物质产量无显著影响。即影响枯草芽孢杆菌抗菌物质产量的主次顺序为：种子液菌龄＞初始pH＞装液量＞时间＞接种量＞温度。

采用菌落计数法以抑制率评价C3菌株抗菌物质对黑曲霉孢子萌发的抑制活性，通过正交试验得到优化发酵条件为种子液的菌龄12h，种子液接种量2%，发酵培养基装液量75mL/250mL，发酵培养基初始pH 7.0，发酵温度37℃，发酵时间48h。在优化发酵条件下，枯草芽孢杆菌C3产抗菌物质的抑菌活性比优化前提高了26.52%。

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Optimization of fermentation conditions of antibacterial material production byBacillus subtilisC3

YANG Yongqing1,2,XIE Yuanhong1,2,ZHANG Hongxing1,2,XIONG Lixia1,2,MA Xiaodan1,2,LIU Hui1,2*,KONG Baohua3
(1.College of Food Science and Engineering,Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China;2.Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control of Spoilage Organisms and Pesticide Residue,Beijing Laboratory of Food Quality and Safety, Beijing 102206,China;3.College of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

The screenedBacillus subtilisC3 was used to study the fermentation conditions of antibacterial material production.By measuring antibacterial material ofB.subtilisC3 on the inhibition rate ofAspergillus nigerspore germination,an orthogonal experiment with 6 factors and 3 levels was conducted to optimize the fermentation condition.The optimum condition was follows:age of inoculums 12 h,inoculums 2%,fermentation medium with fluid volume 75 ml/250 ml,initial pH 7.0,temperature 37℃,fermentation time 48 h.Under the optimized condition,the activities of antibacterial material byB.subtilisC3 increased 26.52%comparing to the non-optimized one.

Bacillus subtilis;antibacterial material;fermentation condition optimization

Q93-335

A

0254-5071（2014）03-0028-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.008

2014-01-27

国家“十二五”科技支撑计划项目（2012BAD28B02-01）；“十二五”国家高技术研究发展计划（863）项目子课题（2012AA101606-05）；北京市教育委员会面上项目（KM201410020010）

杨永青（1990-），女，硕士研究生，研究方向为食品微生物与发酵。

*通讯作者：刘慧（1963-），女，教授，硕士，研究方向为食品微生物学与功能性发酵食品。