Nisin和柠檬酸对纯培养及鲜切黄瓜中单增李斯特菌的杀菌效果

陈 晨，胡文忠，何煜波，姜爱丽，萨仁高娃

(大连民族学院生命科学学院, 生物化学工程国家民委-教育部重点实验室, 辽宁省食源性病原微生物快速检测与控制工程技术研究中心, 辽宁 大连 116600)

单增李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一种常见的人畜共患病食源性革兰氏阳性致病菌[1]，在自然界中广泛存在[2]，可以通过污染畜禽产品、蔬菜、水果等食物而引起人类感染致病[3-4]。近年来，由LM引起的食品中毒事件时有发生，且引起了人员死亡[5,6]。因此，对LM控制措施成为食品安全领域的研究热点。乳酸链球菌素(nisin)是由某些乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)产生的安全且具有高效杀菌作用的多肽，目前许多国家允许其商业化生产作为食品防腐剂使用[7]，我国于1990 年由卫生部食品监督厅签发了在国内应用 Nisin 作为食品保藏剂的使用合格证明书[8]。有机酸能降低环境 pH 值，破坏细菌细胞壁运输系统和渗透压，扰乱微生物的内稳态，从而抑制微生物生长繁殖，柠檬酸等有机酸常用于控制鲜切果蔬微生物的生长和防止褐变[9-11]。现阶段研究利用nisin和柠檬酸来控制鲜切果蔬中LM的研究较多[12-15]，但同时对比研究nisin、柠檬酸以及二者复配对纯培养LM及接种到鲜切黄瓜的LM的杀菌效果未有报道。本文比较研究了不同浓度的nisin、柠檬酸以及二者复配对纯培养LM，以及人工接种到鲜切黄瓜上的LM处理不同时间后的杀菌效果，为探究鲜切果蔬的贮藏保鲜技术提供新的方法和思路。

1.材料方法

1.1 材料与仪器

黄瓜 购于大连开发区乐购超市；菌株 LM标准菌株（ATCC19115）来自辽宁省疾病控制中心；含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）、含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE）、牛津琼脂（OXA）基础、牛津琼脂（OXA）添加剂 青岛海博生物技术有限公司；蛋白胨 北京陆桥技术有限责任公司；乳酸链球菌素（nisin） 浙江银象生物工程有限公司；柠檬酸：食品级、95%乙醇、无水乙醇等化学试剂为分析纯。

MLS-3020 型全自动高压蒸汽灭菌器日本 SANYO公司；1300系列 A2型二级生物安全柜 美国THERMO FISHER SCIENTIFIC公司；AB135-S型分析天平 瑞士 METTLER TOLEDO公司；BagM ixer-400W型均质器 法国INTERSCIENCE公司；DNP-9052型电热恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司；HYC-326A型医用冷藏箱 青岛海尔特种电器有限公司；YLE-1000型电热恒温水浴锅 北京东方精瑞科技发展有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原菌液的制备 在无菌室的生物安全柜内无菌操作取标准LM菌株，在TSA-YE无菌平板上平行划线活化，36℃培养24～48h后挑取单菌落接种到含有150m L无菌TSB-YE的三角瓶中，充分混匀，将三角瓶放入36℃培养箱中，培养24～48h至初始菌落数大致为107cfu/m L，即原菌液，4℃保存，备用。

1.2.2 接种菌液的制备 原菌液在4℃、5000rpm条件下离心5min后，弃去上清，沉淀用0.1%蛋白胨水冲洗，重复两次，得到浓度约为107cfu/m L的菌悬液，即接种菌液，4℃保存，备用。

1.2.3 样品制备 在无菌室内，将新鲜黄瓜用自来水洗净，用无菌刀将鲜切黄瓜切成约1cm×1cm×1cm的小块，每20g一份置于一个无菌容器中。每份鲜切黄瓜样品接种0.1 m L接种菌液，充分混匀，使样品的初始菌数大致为104～105cfu/g。接种后，样品在生物安全柜中干燥1h。

1.2.4 nisin和柠檬酸对纯培养LM的处理 在无菌室的生物安全柜里以无菌操作将充分混匀的原菌液梯度稀释约为105cfu/m L，即纯培养原菌液。取0.5mL纯培养原菌液分别加入含有4.5m L不同浓度 nisin（10、50、100μg/m L）和柠檬酸（0.1%、0.3%、0.5%）以及二者复配液(10μg/m L+0.1%、10μg/m L+0.3%、50μg/m L+0.1%、50μg/m L+0.3%)的试管中，充分混合振荡不同时间（5、10、15、20 min）后，从中吸取 0.5m L加入到 4.5m l 无菌生理盐水进行梯度稀释，取 100μL 的稀释液涂布于牛津琼脂（OXA）平板上，36℃培养48h后计数[1]。每个处理做2个平行实验。

1.2.5 nisin和柠檬酸对接种LM样品的处理 在无菌室内的生物安全柜里，分别把接种LM的鲜切黄瓜放入含100m L nisin和柠檬酸以及二者复配溶液的无菌烧杯中，搅拌浸泡不同时间（5min、10min、15min、20min），取出容器中的样品置于无菌均质袋中，加入50mL灭菌的0.1%蛋白胨水，在拍击式均质机上连续均质 1min，取上清菌悬液选择合适稀释度用无菌生理盐水进行稀释，取 100μL 的稀释液涂布于牛津琼脂（OXA）平板上，36℃培养48h后计数。每个处理做2个平行实验。

1.3 统计分析

采用 SPSS17.0进行方差分析，用Origin8.0作图.

2.结果与分析

2.1 Nisin对纯培养和鲜切黄瓜LM杀菌效果的比较

图1.不同浓度nisin对纯培养（a）和鲜切黄瓜（b）LM的杀菌效果Fig.1 Disinfection effect of nisin for inactivation of LM in pure culture (a) and on fresh-cut cucumbers (b).

自来水以及不同浓度nisin对纯培养和鲜切黄瓜处理不同时间后残留LM的检测结果如图1a和图1b所示，采用自来水清洗鲜切黄瓜后，鲜切黄瓜和纯培养体系中的 LM 均有所降低，但降幅仅为 0.2～0.4 log cfu/g，说明自来水的杀菌作用十分微弱，单纯采用自来水清洗无法有效控制病原微生物的生长，只有加入高效的杀菌剂才能够保证鲜切果蔬的质量安全[14]。当清洗用水中加入nisin后，随着nisin浓度的增加及作用时间的延长其对LM的杀菌效果逐渐增强（p<0.05），并且对两种介质中LM的杀菌效果存在一定差异。当nisin浓度小于50μg/m L时，纯培养和鲜切黄瓜LM的减少量相当，分别为0.1～1.1 log cfu/m L（纯培养）和0.2～1.1 log cfu/g（鲜切黄瓜），当nisin浓度增加到100μg/mL时，作用5min后使纯培养体系中的LM降低到检测限以下，而对鲜切黄瓜处理15min后才使LM低于检测限。

2.2 柠檬酸对纯培养和鲜切黄瓜LM杀菌效果的比较

图2.不同浓度柠檬酸对纯培养（a）和鲜切黄瓜（b）LM的杀菌效果Fig.2 Disinfection effect of citric acid for inactivation of LM in pure culture (a) and on fresh-cut cucumbers (b).

图2a和图2b分别表示不同浓度柠檬酸对纯培养和鲜切黄瓜LM处理不同时间后的杀菌效果，如图2所示，柠檬酸对LM的杀菌效果也是随着浓度的增加和作用时间的延长而增强（p<0.05）。当柠檬酸浓度较低时对两种体系中LM的杀菌作用无显著差异（p>0.05），当柠檬酸浓度增加到0.5%时，处理10min可以使纯培养中的LM降低到检测限以下，而此时对鲜切黄瓜LM的杀菌对数值仅为1.6 log (cfu/g)，但当其处理15min后，则可使鲜切黄瓜的LM降低到检测限以下。这一研究结果与2.1中 nisin对纯培养和鲜切黄瓜LM杀菌效果一致。分析原因可能是采用nisin或柠檬酸清洗接种后的鲜切黄瓜时搅动不够充分，LM无法与杀菌剂充分接触[16]；也可能是接种到鲜切黄瓜表面的LM进入到了黄瓜组织内部[17]，清洗时杀菌剂需要足够的时间进入黄瓜组织内部杀死LM。

2.3 Nisin和柠檬酸复配对纯培养和鲜切黄瓜LM杀菌效果的比较

Nisin和柠檬酸复配对纯培养和鲜切黄瓜LM杀菌效果如图3所示，总体来看，nisin和柠檬酸复配的杀菌效果要优于二者单独使用（p<0.05）。当nisin和柠檬酸复配浓度为 10μg/m L+0.1%，50μg/m L+0.1%以及10μg/m L+0.3%时，对纯培养体系中LM的杀菌效果高于对鲜切黄瓜中LM的杀菌效果。当二者复配浓度增加到50μg/m L+0.3%时，处理20min后可以使纯培养体系中的LM达到检测限以下；而鲜切黄瓜中的LM仅需15min就可以降低到检测限以下。由此可见，nisin和柠檬酸的复配使二者间产生了协同效应，增强了对LM 的杀菌效果。Xu等人研究表明单独使用 nisin没有使鲜切黄瓜和鲜切莴苣中 LM 的数量显著降低（p>0.05），当nisin与柠檬酸和葡萄籽提取物联合使用后，可显著降低LM的数量（p<0.05）[15]。石玉新等人研究表明nisin和柠檬酸联合使用对嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、荧光假单胞菌的抑菌效果要明显优于柠檬酸单独使用[18]。相对于对纯培养体系中LM 的杀菌效果，浓度越高的柠檬酸和nisin的复配对鲜切黄瓜中的LM作用效果越强，这可能是由于高浓度的柠檬酸有助于增强nisin在鲜切黄瓜组织中的通透性，提高了nisin与LM的有效作用时间。

图3.Nisin和柠檬酸复配对纯培养（a）和鲜切黄瓜（b）的杀菌效果Fig.3 Disinfection effect of nisin combination w ith citric acid for inactivation of LM in pure culture (a) and on fresh-cut cucumbers (b)

3.结论

不同浓度的 nisin和柠檬酸及二者复配对纯培养以及接种到鲜切黄瓜上的单增李斯特菌均具有一定的杀菌作用，杀菌效果随着浓度的增加以及作用的时间延长而增强，且nisin和柠檬酸复配杀菌效果要优于二者的单独使用。100μg/m L nisin和0.5%柠檬酸单独使用可使纯培养和鲜切黄瓜中的单增李斯特菌降低到检测限以下，当二者联合使用时，50μg/m L nisin+0.3%柠檬酸即可使两种介质中的单增李斯特菌降低至检测限以下。

通过比较nisin和柠檬酸及二者复配对两种介质中单增李斯特菌的杀菌效果发现，当nisin和柠檬酸浓度较低时，纯培养及鲜切黄瓜中单增李斯特菌的减少量无明显差异，当浓度较高时，5-10min内即可将纯培养体系中的单增李斯特菌降低到检测限以下，而对于鲜切黄瓜则需要15min；当nisin和柠檬酸二者复配浓度为50μg/m L+0.3%时，使鲜切黄瓜中单增李斯特菌降低到检测限以下需要15min，杀菌时间略短于纯培养体系（20min），在试验选用的其余三组复配浓度条件下，纯培养体系中单增李斯特菌的减少量要高于鲜切黄瓜中单增李斯特菌的减少量。

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