醋酸菌耐酸机制研究进展

郑妍，隋勇*

（1.华中农业大学楚天学院食品与生物科技学院，湖北武汉430205；2.华中农业大学食品科技学院，湖北武汉430070）

醋酸菌耐酸机制研究进展

郑妍1，隋勇2*

（1.华中农业大学楚天学院食品与生物科技学院，湖北武汉430205；2.华中农业大学食品科技学院，湖北武汉430070）

醋酸菌是醋酸发酵的主要工业用菌，而醋酸菌的耐酸性对于醋酸发酵和高浓度醋的生产具有重要意义。最近研究表明，乙醇脱氢酶、磷脂组成和ABC转运子会影响醋酸菌的耐酸性，同时aarA基因、应激蛋白GroES和GroEL的过表达会提高醋酸菌的耐酸性。对醋杆菌属和葡糖醋杆菌属两属醋酸菌某些菌株细胞中可能存在的耐酸因子及其耐酸分子机制进行了综述。通过对醋酸菌耐酸机制研究，筛选出耐高酸的菌株用于食醋生产，将大大推动低能耗液态酿醋工业和新型高浓度醋的发展。

醋酸菌；耐酸；醋杆菌属；葡糖醋杆菌属

醋酸菌（acetic acid bacteria，AAB）是一大类能将乙醇氧化成醋酸的微生物总称。醋酸菌具有多种形态特征，细胞从椭圆到杆状，单生、成对或成链排列，细胞大小为0.6～0.8）μm×（1.0～3.0）μm。其运动的细胞具有周生鞭毛或极生鞭毛两种鞭毛类型。革兰氏阴性菌，不产芽孢，专性好氧，最适生长温度在30℃左右，最适pH值为5.4～6.3[1]。醋酸菌与人类的生产生活密切相关，在食品、饮料、医药、化工等行业都有广泛的应用前景。醋杆菌属（Acetobacter）和葡糖醋杆菌属（Gluconacetobacter）是醋酸发酵过程中重要的微生物种类，且目前发现的具有耐高酸性的醋酸菌都来源于这两个属。

耐高酸的醋酸菌菌株用于食醋生产，能够发酵生产高浓度食醋。高浓度食醋不仅能起到调味杀菌、杀菌消炎等功效，而且具有保护心脑血管、降低血压、抗肿瘤以及美容减肥等多种生理功能。随着公众对食醋保健功效的认识以及对高浓度醋功能研究的深入，工业化生产高效、低成本的液态高浓度酿造醋具有非常大的市场前景。因此，文章通过对醋杆菌属和葡糖醋杆菌属两属醋酸菌某些菌株细胞中可能存在的耐酸因子及其耐酸分子机制进行了综述，细胞质，以期筛选出耐高酸的菌株，对于醋酸发酵和高浓度醋的生产具有重要意义[2]。

1 醋酸菌分类简介

早期的醋酸菌分类系统主要以表型和生理生化特征为依据，随着分子生物学技术和多相分类技术的快速发展，醋酸菌的分类有了较准确的定位，其分类系统在近些年也发生了较大变化[3]。当今成功应用于醋酸菌分类的分子生物学方法主要有：聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）、限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism-polymerase chain reaction，RFLP-PCR）、扩增片段长度多态性分析（amplified fragment length polymorphism-polymerase chain reaction，AFLP-PCR）、随机扩增DNA多态性分析（randomlyamplifiled polymorphic DNA-polymerase chain reaction，RAPD-PCR）、单链构象多态性研究（system security certified practitioner-SSCP）、荧光原位杂交技术（fluorescent in situ hybridization technique，FISH）和基因芯片技术等[4-5]。目前，醋酸菌被归入细菌界（Bacterium）、变形菌门（Proteobacteria）、α-变形菌纲（α-Proteobacteria）、红螺菌目（Rhodospirillales）、醋酸菌科（Acetobacteriaceae）。据当前醋酸菌的分类情况，可分为10个属，59个种[6-8]。对各种醋中醋酸菌的生态学研究发现，在醋酸发酵过程中起主导作用的微生物主要来源于醋杆菌属（Acetobacter）和葡糖醋杆菌属（Gluconacetobacter）。表1所示为从各种醋中分离得到醋酸菌的种类[8-10]。

表1 从各种醋中分离得到的醋酸菌种Table 1 Acetic acid bacteria species isolated from different kinds of vinegar

2 醋酸菌耐酸机制

不同种类的醋酸菌耐酸性差异很大，已发现能耐受最高醋酸浓度环境的是Ga.europaeus，其能耐受环境中10%的醋酸，醋酸发酵中最常用的A.aceti和A.pasteurianus两种醋酸菌只能耐受不超过6%的醋酸[11-12]，而Saccharibacter和Asaia两属的醋酸菌则几乎不能在含醋酸的培养基中生长[13-14]。醋酸菌的耐酸性与微生物细胞的结构，以及细胞膜和细胞质中各种酶的含量密切相关。NAKANO S等[15]认为Acetobacter和Gluconacetobacter两属醋酸菌可能的耐酸因子有细胞膜上的以吡咯喹啉醌为辅酶的乙醇脱氢酶、磷脂组成、依赖质子动能势的外排系统、三磷酸腺苷结合盒转运子，细胞质中的三羧酸循环中的一些酶、应激蛋白GroES和GroEL等。此外，一些醋酸菌还能通过改变细胞形态、在细胞表面形成糖膜等方式提高耐酸性。

2.1 细胞膜上的耐酸因子

2.1.1 以吡咯喹啉醌为辅酶的乙醇脱氢酶酶活水平和耐酸稳定性

吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）是一种重要的辅酶，广泛存在于革兰氏阴性菌中，参与电子传递，具有提高某些微生物对辐射、高酸、高温等极端环境的适应能力的作用[16]。乙醇脱氢酶（ethanoldehydrogenase，ADH）和乙醛脱氢酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）是醋酸发酵过程中重要的两种酶，它们均结合于醋酸菌细胞膜上，位于细胞膜外侧。

TECEK J等[17]探讨了不同种耐酸醋酸菌生长特性与其PQQ-dependent ADH分子特征的关系。结果显示，Ga. europaeus能够耐受10%的醋酸环境，而Ga.intermedius和A.pasteurianus只能耐受6%的醋酸环境。这一方面是由于Ga.europaeus和Ga.intermedius的ADH活性是A.pasteurianus的2倍；另一方面Ga.europaeus的ADH活性在高酸性环境中更稳定，3种微生物的ADH活性都会随着培养条件中醋酸含量的增加而降低，Ga.intermedius和A.pasteurianus降低速度很快，当酸度达到10%时，其ADH活性分别仅为初始活性的15%和2.3%，而Ga.europaeus酶活保存率达70%。研究表明，Ga.europaeus细胞较高的PQQ-dependent ADH活性和纯化的PQQ-dependent ADH耐酸稳定性是其能够在高酸性环境中生长和保持代谢活性的两个重要条件。环境中醋酸含量会对PQQ-dependent ADH的表达产生影响，通过比较3株Gluconacetobacte和1株Acetobacter在不同浓度醋酸环境下ADH活性发现，4株醋酸菌ADH活性在醋酸浓度从1%升至2%时增加，而在醋酸浓度从2%升至3%时降低，而Ga.europaeus始终是ADH活性最高的菌株。结果表明，醋酸含量对PQQ-dependent ADH表达的影响不能从转录水平进行阐明，提示调控醋酸菌细胞膜PQQ-dependent ADH的表达是在转录后水平[11]。在对A.pasteurianus耐酸性的研究中，发现ADH活性的破坏会导致其耐醋酸能力的丧失[18]。

2.1.2 细胞膜组成与耐酸性

早在2000年，GOTO H等[19]就比较了产高浓度醋酸的A.polyoxogenes和中等浓度醋酸Acetobactersp.两种醋酸菌细胞膜磷脂组成，研究发现A.polyoxogenes磷脂酰胆碱的含量显著高于Acetobactersp.，而磷脂酰乙醇胺的含量显著低于Acetobactersp.，但两种醋酸菌细胞膜磷脂脂肪酸都是以顺式十八碳烯酸为主，占总脂肪酸含量的80%以上。高磷脂酰胆碱和低磷脂酰乙醇胺含量被认为是对产高浓度醋酸更有利。HANADA T等[20]也发现了醋酸菌细胞膜组成对其耐酸性的影响，对一株耐酸的A.aceti进行研究，找到了催化磷脂酰乙醇胺发生甲基化生成磷脂酰胆碱的磷脂酰乙醇胺甲基转移酶的基因。通过使用基因失活的方法，证明了细胞膜中的磷脂酰胆碱不仅是磷脂的主要成分，而且是A.aceti产生高耐醋酸能力的必要因素。TECEK J等[11]探究了高耐酸性的Ga.europaeus通过改变细胞膜脂质组成等来适应醋酸环境。顺式十八碳烯酸是Ga.europaeus细胞膜中主要的不饱和脂肪酸，其随着培养基中醋酸含量的增加而增加。顺式十八碳烯酸也是其他多数醋酸菌细胞膜的主要不饱和脂肪酸，与之相对应的是，Saccharibacter细胞中主要的不饱和脂肪酸是2-羟基棕榈酸，而Saccharibacter几乎不能在＜0.35%的醋酸环境中生长。对Ga.europaeus细胞膜中糖脂和磷脂含量进行分析，发现与生长在不含醋酸培养基的菌株相比，生长在含3%醋酸培养基的菌株细胞中糖脂含量增加了67%，而总磷脂含量降低了16.3%。细胞膜中磷脂含量最高的是磷脂酰胆碱，其中磷脂酰甘油和磷脂酰胆碱的含量分别增加了7.3和1.3倍，而磷脂酰乙醇胺的含量却有所降低。糖脂含量的增加和磷脂总量的降低都会导致细胞疏水屏障作用的增强，使醋酸等亲脂分子被动运输可利用区域面积的减小，避免醋酸等在细胞质中积累。磷脂酰胆碱含量增加伴随磷脂酰乙醇胺含量降低，对于醋酸菌产生高耐醋酸活性十分有利。磷脂酰甘油作为一种重要的阴离子磷脂不仅涉及细胞膜的完整性，而且参与其他一些细胞过程，如代谢产物的跨膜运输等，但从分子生物学水平阐明其在耐酸醋酸菌中发挥耐酸作用的机理有待进一步研究。

2.1.3 依赖质子动能势的外排系统

在对一些Acetobacter耐醋酸机制的研究过程中，发现一种能适应高浓度醋酸的A.aceti细胞质内醋酸盐的浓度要显著低于不能适应高浓度醋酸环境的醋酸菌。有学者推测在细胞质膜上可能存在一个外排泵，能够将醋酸从细胞质中外排出细胞质膜，但是早期通过蛋白质组学方法研究的A.aceti与醋酸适应性相关的50多种蛋白质中，没有发现某种蛋白质是期待的外排蛋白。为了验证醋酸菌细胞质膜上是否存在对增强耐酸性有利的外排泵，MATSUSHITA K等[21]采用同位素标记的方法研究了醋酸及醋酸盐在完整A.acetiIFO 3283细胞中的转运。可能的转运机制是乙醇利用细胞质外膜上乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的催化作用发酵产生醋酸，同时产生电子。生成的醋酸通过被动运输的方式从周质空间穿过细胞质膜进入细胞质中，在细胞质中逐渐积累，当累积的醋酸浓度过高时就会对醋酸菌产生毒性。终端泛醌氧化酶利用乙醇发酵生成的电子在将氧气氧化成水的过程中同时产生质子动能势，细胞质膜上的外排泵利用质子动能势将被动运输进入细胞质内的醋酸排出，避免醋酸的累积对醋酸菌生长和代谢产生影响，使其能够耐受高浓度醋酸环境。

2.1.4 假定的三磷酸腺苷结合盒转运子

三磷酸腺苷结合盒转运子（ATP-binding cassette transporter）简称ABC转运子，定位于细胞膜上，负责细胞内外物质的转运，在动物、植物和微生物中都广泛存在[22]。ABC转运子超家族根据氨基酸顺序目前已发现有8个亚家族，分别为A、B、C、D、E、F、G、H。研究最多的是ABCA1转运子，人类完整的ABCA1基因组序列及其启动子和调控元件早在20世纪90年代末就已经被确定。ABCA1参与脂质转运，在拮抗动脉粥样硬化以及促进巨喷细胞内胆固醇流出等方面发挥着重要作用，但是关于醋酸菌细胞膜上ABC转运子的研究还鲜见报道[23]。NAKANO S等[24]首次发现了一种假定的ABC转运子对A.aceti耐酸性的影响，这种假定的ABC转运子是A.aceti细胞膜上的一种由醋酸刺激产生的蛋白质。通过双向电泳的方法对在醋酸环境中导致A.aceti细胞膜产生的一系列蛋白质进行分析，发现了一种分子质量为60ku且对醋酸很敏感的蛋白，命名为AatA。对AatA进行分子生物学分析，发现其含有591个氨基酸并且含有ABC转运子的特征序列，属于ABC转运子超家族。研究表明过表达的AatA能够使A.aceti在高浓度醋酸环境中生长和代谢，并且产生大量的醋酸，这可能与A.aceti维持较低的细胞内醋酸以增加其自身耐酸性有关。Southern印迹分析和核苷酸序列分析发现Acetobacter和Gluconacetobacter两属醋酸菌存在AatA基因同源性，而已报道的高耐醋酸的醋酸菌也都来源于这两个属，进一步验证了AatA蛋白这种假定的ABC转运子与醋酸菌耐酸性的关系。

2.2 细胞质中的耐酸因子

2.2.1 三羧酸循环中的一些酶的过表达

A.aceti能够将乙醇转化成醋酸用于酿醋表明其具有耐受乙醇和醋酸的能力，通过耐受细胞质的酸化降低醋酸累积对A.aceti细胞的毒害作用，表明细胞质中可能存在一些能够适应酸性环境的物质。研究表明，三羧酸循环中的一些酶与A.aceti的耐酸性密切相关，如柠檬酸合酶、乌头酸酶和琥珀酰辅酶A转移酶等[25]。对可能与A.aceti耐酸性相关的基因进行研究发现，aarA、aarB和aarC3个基因会影响A.aceti的耐酸性。从核苷酸序列推导出aarA基因产物的氨基酸序列显著类似于柠檬酸合酶的氨基酸序列。A.aceti突变体aarA基因存在缺陷被发现缺乏柠檬酸合酶活性，而当通过引入含有aarA基因的质粒后柠檬酸合酶活性恢复，说明aarA基因就是柠檬酸合酶基因，表明细胞中的柠檬酸合酶与A.aceti耐酸性密切相关[26-27]。通过双向电泳的方法对在醋酸环境中导致A.aceti细胞可溶部分（主要是细胞质）中产生的一系列蛋白质进行分析，发现了一种分子质量为100 ku且在含有醋酸的培养基中大量产生的蛋白。对蛋白质氨基端氨基酸序列分析和基因克隆，推测其为乌头酸酶。利用多拷贝质粒使A.aceti细胞中乌头酸酶基因放大，发现乌头酸酶活性和耐酸性均增强，表明A.aceti耐酸性与乌头酸酶活性密切相关。具有多拷贝乌头酸酶基因的A.aceti能够产生更高浓度的醋酸并降低生长对数期时间，乌头酸酶活性和耐酸性均增强也使得其产醋酸的量增加了25%，对于提高醋酸发酵产量具有实际意义[28]。

以上研究表明，增强三羧酸循环中的一种或多种酶的活性，如柠檬酸合酶和乌头酸酶等，都会使得发酵产生的醋酸快速消耗或破坏过多的醋酸渗入细胞质内对细胞产生毒害，使细胞内的醋酸维持在较低水平，A.aceti耐酸性增强。

2.2.2 应激蛋白GroES和GroEL的过表达

目前，微生物应激蛋白与对各种应激因素耐性的研究越来越受到关注。热应激蛋白（heat stress proteins，HSP）是一种典型的应激蛋白生物细胞受到高温、病原体、细胞因子、理化有害因素等刺激时，选择性合成的一组高度保守的蛋白质。GroES和GroEL分别隶属于HSP10和HSP60蛋白质家族，是被广泛研究的应激蛋白。它们参与调整许多细胞蛋白质的正确折叠和装配，能避免蛋白质的错误折叠，促进蛋白质的再折叠和正确组装[29]。GroES和GroEL也是分子伴侣蛋白家族的成员，不仅由温度变化刺激产生，而且也会受其他因素如乙醇和醋酸等刺激产生。研究表明，过量表达GroEL操纵子的A.aceti不仅比对照组能耐受更高的发酵温度，而且能够耐受更高浓度的乙醇和醋酸。此外，胞内蛋白质和一般应激蛋白如伴侣蛋白的内在稳定性也有助于醋酸抗性的表型表达[30]。

2.3 其他因素对醋酸菌耐酸性的影响

2.3.1 改变细胞形态

一些微生物具有通过改变细胞形态来应对外源或代谢过程中产生的不利于生长的物质对细胞产生毒害作用的能力。TECEK J等[11]探究了高耐酸性的Ga.europaeus通过改变细胞形态来适应醋酸环境，通过扫描电镜观察两种醋酸菌细胞在无醋酸的培养基中均呈现出短棒状，当培养基中醋酸浓度为3%时，Ga.europaeus细胞变为较长棒状并在细胞膜外出现小凹陷，而A.pasteurianus细胞形态几乎无变化。随着培养基中醋酸浓度升至7%，Ga.europaeus细胞呈现更长更细的棒状。Ga.europaeus细胞尺寸的增大使得醋酸被动扩散进入细胞区域的相对面积减小，降低醋酸在细胞内积累对微生物的毒害作用，使其能够耐受较高浓度的醋酸。此外，从扫描电镜图可以明显发现Ga.europaeus细胞表面较为粗糙，而A.pasteurianus细胞表面则比较光滑，有研究表明粗糙的表面是被多糖包裹，这也是一些醋酸菌具有耐酸能力的典型特征。

2.3.2 糖膜形成与耐酸性

Acetobacter是醋酸发酵过程中重要的醋酸菌菌种，通过对A.pasteurianus、A.tropicalis和A.aceti等研究发现，可以按细胞形态将Acetobacter分成R型和S型两类，R型Acetobacter细胞表面被多糖包裹，形成糖膜，使得细胞表面较为粗糙，与之相反的是S型种Acetobacter细胞表面不能形成糖膜，细胞表面光滑[31-33]。KANCHANARACH W等[34]同样按细胞形态不同将A.pasteurianusIFO3283、SKU1108、MSU10分成R型种和S型两类。通过对细胞表面糖膜形成与醋酸菌醋酸发酵产量关系的研究，发现R型A.pasteurianus能够产生更多的醋酸并且展现出醋酸的过氧化能力，而S型A.pasteurianus产生醋酸的量较少且不具有醋酸过氧化能力，醋酸菌在过氧化阶段通过氧化消耗醋酸也被认为是具有耐酸性的重要表现，表明R型比S型A.pasteurianus展现出更强的耐醋酸能力可能与R型A.pasteurianus细胞表面形成的糖膜有关。对细胞表面糖膜形成与醋酸菌醋酸转运关系的研究，发现S型A.pasteurianus将醋酸和醋酸盐转运至细胞内的量比R型高3～4倍，表明醋酸分子更容易通过没有糖膜包被的S型A.pasteurianus细胞的细胞膜。细胞表面糖膜的形成能够有效阻止醋酸转运和被动扩散到细胞内，降低醋酸在细胞内的累积对醋酸菌生长和代谢的影响，使醋酸菌具有更强的耐酸能力，发挥高浓度醋酸发酵能力。

3 结论

通过对醋酸菌耐酸机理的研究发现，醋酸菌细胞膜上以吡咯喹啉醌为辅酶的乙醇脱氢酶（PQQ-dependent ADH）酶活水平和耐酸稳定性的提高、依赖质子动能势的外排系统的存在、转运蛋白ABC转运子的过表达，以及细胞质中三羧酸循环相关酶（如柠檬酸合酶、乌头酸酶）和应激蛋白（如GroES、GroEL）的过表达等均能提高醋酸菌的耐酸性。此外，某些醋酸菌还能通过细胞尺寸的增大使得醋酸被动扩散进入细胞区域的相对面积减小以及在细胞表面形成糖膜等方式，降低醋酸在细胞内积累对微生物的毒害作用，使其能够耐受较高浓度的醋酸。

高耐酸性的醋酸菌在生产高浓度醋酸方面具有很高的应用前景。选育高产醋酸工程菌株用于食醋生产、高浓度醋酸发酵技术生产高浓度食醋等，这都需要对醋酸菌可能存在的耐酸因子及其耐酸分子机制进行广泛和深入研究。因此，通过对醋酸菌耐酸性的研究，筛选出具有耐高酸和产酸速率快的菌株应用于发酵醋的生产，将大大推动低能耗的液态酿醋工业和新型高浓度醋的发展。

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Progress of acid resistance mechanism of acetic acid bacteria

ZHENG Yan1,SUI Yong2*

(1.College of Food Science and Biotechnology,Chutian College Huazhong Agricultural University,Wuhan 430205,China; 2.College of Food Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China)

Acetic acid bacteria are the main bacteria in acetic acid fermentation industry,and the acetic acid resistance plays an important role in acetic acid fermentation and high-acid vinegar production.According to recent research,ethanol dehydrogenase,phospholipids and ATP-binding cassette transporter would affect the acetic acid resistance of acetic acid bacteria.In addition,the over expression ofaarAgene,stress proteins GroES and GroEL would enhance the acetic acid resistance as well.The acetic acid resistance factors and molecular mechanisms ofAcetobacterand Gluconacetobacterwere reviewed in this article.Through the acetic acid bacteria mechanism research,high acid-resistant strains were screened for vinegar production,which would greatly promote the development of low-power consumption liquid vinegar industry and new type of high concentration vinegar.

acetic acid bacteria;acetic acid resistance;Acetobacter;Gluconacetobacter

TS264.2

A

0254-5071（2014）07-0024-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.005

2014-05-16

郑妍（1986-），女，助教，硕士，研究方向为食品科学与工程。

*通讯作者：隋勇（1987-），男，博士研究生，研究方向为食品科学与工程。