铜和温度对厚壳贻贝早期幼虫生长和存活的影响

顾忠旗，李一峰，郭行磐，陈芋如，周民栋，黄继，杨金龙

(1．浙江省嵊泗县海洋科技研究所，浙江舟山，202450;2．上海海洋大学省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海201306)

过去几十年间，人类活动的急剧增加已导致了环境中重金属含量不断上升［1］。铜是软体动物生长所须的微量元素，但在过量的情况下其对生物体具有毒性［2-4］。在自然海洋环境中，Cu(Ⅱ)质量浓度通常低于5 μg/L，而在被污染的海域能高达800 ～1000 μg/L［5］。海洋中 Cu(Ⅱ)污染的严重性已引起了人们的广泛关注和重视。双壳类动物不但易于采集，而且对环境污染物很敏感并能作出快速的反应［6-8］，所以经常被用于监测海洋环境或养殖水体环境污染的情况。

厚壳贻贝Mytilus coruscus为中国重要的贝类养殖品种，也是主要的筏式养殖贝类之一，其分布于黄海、渤海和东海沿岸［9］，其中以浙江沿海资源量最大。近年来，人为过度采捕导致厚壳贻贝自然资源逐渐减少，同时由于环境的污染和生态的破坏，使厚壳贻贝养殖产业受到严重影响。

有关Cu(Ⅱ)对海洋无脊椎动物毒性的研究已有许多报道，而Cu(Ⅱ)对厚壳贻贝早期幼虫的急性毒性却鲜有报道。为了有效地评估Cu(Ⅱ)的毒性大小和厚壳贻贝对Cu(Ⅱ)胁迫的敏感程度，本研究中利用东海区的常见种厚壳贻贝作为受试生物，研究了不同温度(10、14、17℃)和Cu(Ⅱ)质量浓度 (7．40、32．63、56．58、193．94、300．48 μg/L)的耦合作用对厚壳贻贝D形幼虫生长和存活的影响，旨在为该种的水产养殖提供科学参考，也为环境保护及污染检测提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1．1．1 受试生物 成体厚壳贻贝采自浙江省嵊泗县枸杞岛附近海域，依照Yang等［10］的方法进行人工授精和幼虫培育。试验过程中，使用受精卵孵化后4日龄的D形幼虫，其壳长为 (81．1±4．2)μm，壳高为 (59．5 ± 4．6)μm。

1．1．2 试验用水及药品 试验用水取自浙江省嵊泗县枸杞岛海域，盐度为30，pH为8．11，铵态氮和亚硝酸氮含量分别为 0．0012、0．0110 mg/L。CuCl2·2H2O(AR)购自于上海国药集团化学试剂有限公司，用GF/C滤膜 (Whatman玻璃纤维滤膜，孔径为1．2 μm)过滤的海水配制成含Cu(Ⅱ)质量浓度为10 mg/L的母液，测试溶液按要求进行稀释。

1.2 方法

试验在黑暗条件下进行，设制10、14、17℃3个温度，每个温度下均设4个Cu(Ⅱ)质量浓度组(10、50、100、300 μg/L)和1个对照组，每个试验设3个平行组，并进行3次重复试验。Cu(Ⅱ)质量浓度的测定采用TAS990原子吸收分光光度计，实际测试质量浓度分别为 7．40(对照)、32．63、56．58、193．94、300．48 μg/L。

(1)存活试验。存活试验在玻璃培养皿 (64 mm×19 mm)内进行，每一培养皿放入20 mL由灭菌海水配制的Cu(Ⅱ)溶液，随机选取20只D形幼虫放入。每隔24 h换水1次，换水后Cu(Ⅱ)质量浓度不变，试验过程中不投饵。

(2)生长试验。每个质量浓度组放100只幼虫进行生长试验。每隔24 h测量各质量浓度组幼虫的壳长和壳高，并记录各组幼虫在1、3、6、10、24、48、72、96 h的死亡数。幼虫的死亡标准为在显微镜下观察到幼虫静止不动，双壳张开，多次刺激无反应。

1.3 数据处理

试验数据均用平均值±标准差表示 (mean±S．D．)。采用SPSS 17软件进行统计分析，通过单因素和双因素方差分析 (ANOVA)处理相关数据，显著性水平设为0．05。用直线内插法计算厚壳贻贝D形幼虫的半致死浓度 (LC50)，并采用公式SC=0．01 ×96 h LC50计算安全浓度。

2 结果与分析

2.1 不同温度下Cu(Ⅱ)对D形幼虫存活的影响

10 ℃ 时，对照组和 32．63、56．58、193．94 μg/L Cu(Ⅱ)质量浓度组，所有幼虫直到10 h均存活且处于游泳状态，而300．48 μg/L质量浓度组幼虫10 h后存活率显著下降(P＜0．05)，仅为24%。从图 1可见:Cu(Ⅱ)中暴露 96 h时，32．63、56．58 μg/L质量浓度组幼虫的存活率高于95%，193．94 μg/L质量浓度组的存活率仅为3%，而300．48 μg/L质量浓度组幼虫在24 h后全部死亡。多重比较结果表明:193．94 μg/L质量浓度组幼虫在96 h时的存活率较3个低浓度组显著下降 (P＜0．05);300．48 μg/L 质量浓度组幼虫的存活率较其他浓度组显著下降 (P＜0．05)。

14℃时，10 h内除300．48 μg/L质量浓度组外，对照组和 32．63、56．58、193．94 μg/L 质量浓度组均无幼虫死亡。在 Cu(Ⅱ)中暴露96 h时，32．63、56．58 μg/L 质量浓度组幼虫全部存活，且呈快速游动的状态;在193．94、300．48 μg/L 质量浓度组幼虫的存活率随着在Cu(Ⅱ)中暴露时间的延长而持续下降，96 h时分别为2%和0%。多重比较结果表明:193．94 μg/L质量浓度组幼虫在72 h后的存活率较3个低浓度组显著下降 (P＜0．05);300．48 μg/L 质量浓度组幼虫的存活率较其他浓度组均显著下降 (P＜0．05)。

图1 不同温度下Cu(Ⅱ)质量浓度对厚壳贻贝D形幼虫存活率的影响Fig.1 Survival rates of mussel Mytilus coruscus larvae exposed to copper(Ⅱ)at different temperature

17 ℃ 时，10 h 内对照组和 32．63、56．58、193．94 μg/L 质量浓度组均无幼虫死亡，300．48 μg/L质量浓度组6 h和10 h时幼虫的存活率分别降至6%和0%。在Cu(Ⅱ)中暴露96 h时，32．63 μg/L质量浓度组有3%的幼虫死亡，56．58 μg/L质量浓度组有近20%的幼虫死亡，193．94 μg/L质量浓度组48 h时的存活率显著降低 (P＜0．05)，并且在96 h全部死亡。多重比较结果表明:193．94 μg/L质量浓度组幼虫在48 h后的存活率较3个低浓度组显著下降 (P ＜0．05);300．48 μg/L质量浓度组幼虫的存活率较其他浓度组显著下降(P ＜0．05)。

Cu(Ⅱ)和温度的双因素方差分析结果表明，96 h后温度、Cu(Ⅱ)质量浓度及其交互作用均极显著影响幼虫的存活率 (P＜0．05)(表1)。

表1 96 h时Cu(Ⅱ)质量浓度和温度对厚壳贻贝D形幼虫毒性影响的双因子方差分析结果Tab.1 Two-factor analysis of variance of the effects of copper(Ⅱ)concentration and water temperature on the survival rates of mussel Mytilus coruscus D-veliger larvae in 96 h

根据幼虫在不同温度、不同质量浓度Cu(Ⅱ)胁迫下的试验结果，计算得到Cu(Ⅱ)对厚壳贻贝D形幼虫的LC50如表2示。从表2可见:随着温度的升高LC50不断降低，在48 h时，17℃组的LC50仅为171．1 μg/L，远低于 10、14℃组;在 96 h时，17℃组的 LC50最小，仅为133．0 μg/L。推算得到，Cu(Ⅱ)胁迫下厚壳贻贝 D形幼虫在10、14、17℃时的安全浓度 (SC)分别为 14．36、14．35、13．30 μg/L。

表2 厚壳贻贝D形幼虫在不同温度下的半致死浓度Tab.2 LC50of mussel Mytilus coruscus exposed to copper at different temperatures

2.2 不同温度下Cu(Ⅱ)对D形幼虫生长的影响

D形幼虫暴露于不同质量浓度的Cu(Ⅱ)下，其壳长的生长及相对增长率分别如图2和表3所示。从图2可见:17℃时193．94 μg/L质量浓度组暴露72 h后以及10、14、17℃时300．48 μg/L质量浓度组，暴露96 h后幼虫全部死亡，故没有幼虫壳长生长的数据。从表3可见:暴露48 h，10、14、17℃时不同Cu(Ⅱ)质量浓度下幼虫的壳长相对增长率均无显著性差异 (P＞0．05);暴露96 h时，3种水温下随着Cu(Ⅱ)质量浓度的增加，幼虫的壳长相对增长率基本呈下降趋势，且在同一质量浓度下，17℃ 组幼虫的壳长相对增长率显著高于10、14 ℃组(P ＜0．05)，在32．63 μg/L 质量浓度下，10、14℃两组壳长相对增长率间有显著性差异 (P＜0．05)，在其他浓度下均无显著性差异 (P ＞0．05)。

图2 不同温度下Cu(Ⅱ)质量浓度对D形幼虫壳长生长的影响Fig.2 Shell length growth of mussel Mytilus coruscus larvae exposed to copper(Ⅱ)at different temperature

表3 Cu(Ⅱ)暴露下D形幼虫壳长的相对增长率Tab.3 Relative growth rates in shell length of mussel Mytilus coruscus D-veliger larvae exposed to copper(Ⅱ)at different temperature

3 讨论

通常情况下，生物体对污染物的敏感性取决于生物体的种类和该生物体所处的发育阶段［11-12］。Fitzpatrick等［7］研究了Cu(Ⅱ)对贻贝胚胎发育、卵子活力和精子的受精能力，结果表明，胚胎对Cu(Ⅱ)胁迫最敏感。周光锋等［13］研究发现，厚壳贻贝稚贝暴露于温度为27．2℃的Cu(Ⅱ)水中，其96 h LC50为194 μg/L。本研究中，17℃下厚壳贻贝D形幼虫的LC50为133．0 μg/L，低于厚壳贻贝稚贝的LC50，表明厚壳贻贝幼虫可能对Cu(Ⅱ)的耐受能力较稚贝弱。同时，本研究中，17℃时32．63、56．58 μg/L 质量浓度组厚壳贻贝幼虫无死亡现象出现，而 Mac Innes等［14］在进行不同Cu(Ⅱ)质量浓度对美洲牡蛎Crassostrea virginica幼虫毒性试验时发现，高温 (20℃)时 30、60 μg/L Cu(Ⅱ)质量浓度下早期幼虫的死亡率分别为2．7%和2．4%，显著高于厚壳贻贝早期幼虫的死亡率，表明厚壳贻贝早期幼虫对Cu(Ⅱ)胁迫的耐受力比美洲牡蛎早期幼虫相对较强。

本研究中，高温下的幼虫比低温下幼虫对Cu(Ⅱ)胁迫更为敏感，尤其是在 193．94 μg/L质量浓度下。以往研究表明，在不同水温条件下，Cu(Ⅱ)胁迫对美洲牡蛎早期幼虫毒性的影响变化较大［14］。高温使金属盐类的溶解度增加，水和溶质在细胞膜内外扩散速度也相应加快［15］。因此，在高温下，Cu(Ⅱ)对生物体的毒性有可能较低温时高。

温度是影响动物生长发育的重要环境因子。本试验中，研究了幼虫在Cu(Ⅱ)胁迫下的壳长相对增长率，结果表明，随着Cu(Ⅱ)质量浓度的升高，在10℃时，其壳长相对增长率呈逐渐降低的趋势，14℃时，呈先降低后升高的趋势，17℃时，呈逐渐升高的趋势;96 h时高温组 (17℃)的壳长相对增长率显著高于低温组 (10、14℃)，表明尽管随着温度的升高幼虫的LC50下降，但相对生长率仍然随温度的升高而增大，这可能是随环境温度的升高使其代谢加快所致。

Cairns等［15］认为，温度可以作为一个反应的调节器或控制器。温度的改变可能使某种化合物对生物体的毒性加强或减弱。因此，温度的改变，有可能使得最小致死浓度上升或降低，在致死浓度下生物体的存活时间也会改变。Cu(Ⅱ)在持续高温时可能对幼虫的毒性较低温时更强，这样就使生物体更容易超过其所能耐受的限度，进而影响其存活。

综上所述，在同一水温下，193．94、300．48 μg/L Cu(Ⅱ)质量浓度能显著降低幼体的存活率并抑制其壳长生长;在同一Cu(Ⅱ)质量浓度胁迫下，高水温 (17℃)Cu(Ⅱ)暴露组的壳长相对增长率显著高于低水温 (10、14℃)组。本研究表明，水温和Cu(Ⅱ)影响厚壳贻贝早期幼虫的存活和生长。

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