多棘海盘车化学成分的分离与鉴定

田丽冉，侯秀秀，佟长青，谭成玉，李伟

(1．大连海洋大学食品科学与工程学院，辽宁大连116023;2．大连海洋大学海洋科技与环境学院，辽宁大连116023)

多棘海盘车Asterias amurensis Lutken隶属于海盘车科 Asteriidae、海盘车属Asterias，是一种海洋无脊椎动物。海星中含有多糖、脂类、甾醇、皂苷、生物碱等多种化学成分和活性物质，具有广泛的药理作用和生物活性。海洋活性物质因支链丰富多样、骨架结构新奇、生理活性独特而备受关注［1］。国内外学者已从海星中分离纯化出了多种具有生物活性的化学成分，但仍然有许多具有潜在价值的化合物尚未分离得到。为了更加全面分析多棘海盘车所含有的化合物，本研究中从多棘海盘车70%乙醇提取物的乙酸乙酯和正丁醇萃取部分中，利用多种色谱技术相结合的手段，首次从多棘海盘车中分离得到4种化合物，并对其结构进行了鉴定，旨在为多棘海盘车的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用多棘海盘车采自辽宁省大连市黑石礁海域。

试验药品主要有硅胶 (200～300目)(Sigma公司)、Sephadex LH-20葡聚糖凝胶 (Sigma公司)、ODS反相硅胶 (200～300目)(购于北京吉瑞森科技有限责任公司)。乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等均为国产分析纯。

试验仪器主要有RE-52CS型旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器厂)、ZF-90型暗箱式紫外透射仪(上海顾村电光仪器厂)、XT5型显微熔点测定仪(熔点未校正，北京科仪电光仪器厂)、BRUKERAPX-300型1H核磁共振仪 (瑞士 BRUKER公司)、BRUKER-APX-150型13C核磁共振仪 (瑞士BRUKER公司)。

1.2 方法

1．2．1 多棘海盘车化合物的分离 取20 kg多棘海盘车剪碎，用体积分数为70%的乙醇回流提取2次，每次2 h，过滤，合并提取液，用旋转蒸发器减压浓缩得到水溶液，置于冰箱 (-20℃)中保存备用。

依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇对提取得到的水溶液进行多次萃取，直至有机层基本无色，浓缩，分别得到石油醚部分 (65 g)、乙酸乙酯部分 (130 g)和正丁醇部分 (150 g)。

将正丁醇部分进行硅胶柱色谱分离，以乙酸乙酯与甲醇的混合液 (二者的比为100∶0，100∶1，…，10∶1，…，1∶1)进行梯度洗脱得到6个组分。其中组分2重结晶得到化合物1(68 mg);组分3进行硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷与甲醇的混合液 (二者的比为100∶0，100∶1，…，10∶1，…，1∶1)进行梯度洗脱得到的亚组分c反复运用凝胶柱进行分离，得到化合物2(18 mg);组分4进行硅胶柱色谱分离，以乙酸乙酯与甲醇的混合液(二者的比为100∶0，100∶1，…，10∶1，…，1∶1)进行梯度洗脱得到的亚组分b反复运用凝胶柱分离，得到化合物3(40 mg)。将乙酸乙酯部分反复运用硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷与甲醇的混合液 (二者的比为100∶0，100∶1，…，10∶1，…，1∶1)进行梯度洗脱，结合Sephadex LH-20分离，最终得到化合物4(18 mg)。

1．2．2 化合物结构的鉴定1H NMR谱在BRUKER-APX-300型1H核磁共振仪上进行，13C NMR谱在BRUKER-APX-150型13C核磁共振仪上进行。样品均溶于D2O，样品浓度为20 mg/mL。

2 结果

对多棘海盘车70%乙醇提取物，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，得到4种化合物，分别为化合物1、2、3、4。

化合物1 为白色粉末状固体，mp 216～220℃，易溶于甲醇，微溶于氯仿、乙酸乙酯等有机溶剂，分子式为 C41H75NO9。1H NMR谱显示，δH8．52处有酰胺N-H特征信号，δC106．0为糖苷异头碳信号。神经酰胺与鞘胺醇都具有N-酰基神经鞘胺醇的骨架结构，骨架中两个羟基的位置是固定的，同时已经确定羟甲基与糖成苷相连接［2］。结合δH3．85～4．87分子中含有多个连氧碳上的质子，推测此化合物为鞘脂糖苷类化合物。其1D NMR谱数据如下:1H NMR(500 MHz，MeOH)，δH8．52(d，J=8．6 Hz，1H，NH)，7．65(br s，1H，OH)，7．25(br s，1H，OH)，7．17(br s，1H，OH)，6．90(br s，1H，OH)，6．41(br s，1H，OH)，6．20(d，J=15．6 Hz，1H，H-10)，6．00(dd，J=15．4，6．0 Hz，1H，H-4)，5．90(dt，J=15．4，6．2 Hz，1H，H-5)，5．72(m，1H，H-11)，5．48(m，1H，H-8)，5．34(d，J=4 Hz，1H，H-1″)，4．80(m，1H，H-2)，4．75(m，1H，H-3)，4．71(dd，J=10．3，5．9 Hz，1H，H-1)，4．57(m，1H，H-2')，4．50(br d，J=10．3 Hz，1H，H-6″)，4．36(m，1H，H-6″)，4．23(m，1H，H-1)，4．21(m，2H，H-3″，H-4″)，4．03(m，1H，H-2″)，3．90(m，1H，H-5″)，2．21(m，2H，H-7)，2．16(m，3H，H-3'，H-6)，2．12(m，2H，H-12)，2．00(m，1H，H-3')，1．76(s，3H，H-19)，1．75(m，2H，H-4')，1．36(m，4H，H-5'，H-13)，1．29(br s，28H)，0．90(t，J=6．7 Hz，6H，H-18，H-16')。其13C NMR(125 MHz，MeOH)谱数据如下:δ 177．2(s，C-1')，134．8(d，C-10)，133．4(s，C-9)，132．3(d，C-4)，132．0(d，C-5)，130．9(d，C-8)，128．5(d，C-11)，104．7(d，C-1″)，78．0(d，C-5″)，77．9(d，C-3″)，75．0(d，C-2″)，73．1(d，C-2')，72．9(d，C-3)，71．6(d，C-4″)，70．0(t，C-1)，62．7(t，C-6″)，54．6(d，C-2)，35．9(t，C-3')，33．5(t，C-12)，33．1(t，C-6)，33．1(t)，33．0(t)，30．9(2xt)，30．9(2xt)，30．8(2xt)，28．2(t，C-7)，26．2(t，C-4')，23．8(2xt)，14．5(2xq，C-18，C-16')，12．8(q，C-19)。查阅相关文献发现，此化合物的波谱数据与文献报道的Phalluside 1基本一致，故确定化合物1为Phalluside 1，结构为1-O-(β-D-葡萄糖基)-(4E，8E，10E)-2-(2'R-2-羟基十八烷基酰胺基)-4，8，10-三烯-1，3-二醇 ［1-O-(β -D-glucose)-(4E，8E，10E)-2-(2R'-2-hydroxy octadecyl)-4，8，10， -amide-1，3-diol］［3］。

化合物2 为白色晶体，mp 279～282℃，易溶于氯仿，微溶于甲醇，不溶于水，分子式为C47H75NO2。Liebermann-Burchard反应呈阳性，提示可能为甾体类化合物。其1D NMR谱数据如下:1H NMR(500 MHz，CDCl3)，δH5．36(m，2H，H-6，H-6')，5．10(d，J=8．2，1 H，NH)，3．73(m，1 H，H-3)，3．52(m，1 H，H-3')，1．01(s，3 H，H-19)，0．99(s，3 H，H-19')，0．91(d，J=6．5，3H，H-21)，0．87(d，J=6．6，3H，H-26)，0．86(d，J=6．6，3H，H-27)，0．70(s，3 H，H-18')，0．67(s，3H，H-18)。其13C NMR(125 MHz，C5D5N)谱数据如表1所示。查阅相关文献发现，化合物2的结构为N-(胆甾-5-烯-3β-烃基)-3β-醋酸酯-5-乙基-17β-咪唑羧酰胺 ［N-(Cholest-5-en-3β -yl)-3β -hydroxyandrost-5-ene-17β -carboxamide］［4］。

化合物3 为白色无定形粉末，mp 145～148℃，易溶于吡啶，微溶于甲醇、氯仿，不溶于水，分子式为C27H44O。Liebermann-Burchard反应呈阳性，提示可能为甾体类化合物。其1H-NMR(500 MHz，C5D5N)波谱中:5个甲基质子信号为1．86(3H，s，18-Me)，2．06(3H，d，19-Me)，2．07(3H，d，J=6．5 Hz，26-Me)，2．15(3H，d，J=6．5 Hz，27-Me)，2．24(3H，d，J=6．5 Hz，21-Me)，2个烯氢质子信号为6．14(1H，s，H-6)和6．61(1H，s，H-22)，1个连氧碳的氢信号为5．04(1H，s，H-3)。13C NMR低场可观察到4个烯碳信号，其中δC140．1、121．7提示为△5(6)双键。其13C NMR(125 MHz，C5D5N)波谱数据如表2所示，从NMR谱图数据中可看出，比胆固醇多了一个碳碳双键。查阅相关文献发现，化合物3的结构为胆甾-5，20(22)-二烯 -3β-醇［Cholest-5，20(22)-diene-3β -ol］［5］。

表1 化合物2的13C NMR波谱数据Tab.1 13C NMR data of compound 2

表2 胆固醇和化合物3的13C NMR波谱数据Tab.2 13C NMR data of cholesterol and compound 3

化合物4 为白色粉末，mp 64～65℃，易溶于氯仿，微溶于甲醇，不溶于水。分子式为C30H60O4。1H NMR显示，高场没有次甲基信号，其中在δH0．87(t，6．4)的末端甲基信号及其相邻的δH1．27处含有46个质子积分面积的叠加峰，暗示该化合物为链状脂肪酸结构。结合其在δH2．34(t，7．5)和 δH1．61(m)分别出现的两个质子信号，说明该化合物为一直链脂肪酸。进一步根据13C NMR的1个羰基碳δC174．53、3个连羟基碳 δC63．49 ～70．40、1 个甲基碳 δC14．25 和分布在δC34．29～22．82之间的25个亚甲基碳信号，推测其结构为三十烷酸甘油酯。其1D NMR谱数据如下:1H NMR(500 MHz，CDCl3)，δ 0．87(t，J=6．4 Hz，3H，Me-27')，1．05-1．27(br s，46H，H-4'to H-26')，1．61(m，2H，H-3')，2．34(t，J=7．5 Hz，2H，H-2')，3．60(dd，J=11．6，5．8 Hz，1H，H-3a)，3．68(dd，J=11．6，3．8 Hz，1H，H-3b)，3．92(m，1H，H-2)，4．14(m，2H，H-1)。其13C NMR(125 MHz，CDCl3)谱数据如下:δ 65．26(C-1)，70．40(d，C-2)，63．49(t，C-3)，174．53(s，C-1')，34．29(t，C-2')，25．04(t，C-3')，29．27-29．83(t，C-4'to C-24')，32．05(t，C-26')，22．82(t，C-25')，14．25(q，C-27')。查阅相关文献发现，化合物4的结构为 (2S)-1-O-7溴烷醇甘油［(2S)-1-O-7 heptatriacontanoyl glycerol］［6］。

3 讨论

提取方法不同对提取的化学成分种类有着明显的影响。李岩等［7］利用酶解、50℃水浸提的方法从海星中分离纯化出6种化合物:胆甾-5-烯-3-醇;丙二酸;乙酸钠;正壬烷;麦角甾-7，9，22-三烯-3-醇;一水合立方癸烷。其中前5种为首次从海星纲中分离得到，一水合立方癸烷为新化合物。程平等［8］利用95%乙醇浸提、正丁醇萃取、大孔树脂层析和ODS、Sephadex LH-20层析分离，从多棘海盘车中分离出6种化合物:Amurensoside D;色氨酸;3β-O-硫酸酯化 -6α，23β-二羟基-胆甾-9(11)-23-羰基-硫酸盐;3β-O-硫酸酯化 -6α-羟基 -胆甾 -9(11);20(22)-二双键-23-羰基-硫酸盐;3β-O-硫酸酯化-6α-羟基-麦角甾-9(11)-双键-23-羰基-硫酸盐。其中色氨酸为首次从多棘海盘车中分离得到。

本研究中从多棘海盘车70%醇提物中得到4种化合物:Phalluside 1;N-(胆甾-5-烯-3β-烃基)-3β-醋酸酯-5-乙基-17β-咪唑羧酰胺;胆甾-5，20(22)-二烯-3β-醇;(2S)-1-O-heptatriacontanoyl glycerol。这4种化合物均为首次从海盘车属中分离得到，其余组分中的化学成分有待进一步分离纯化，其生物活性有待进一步研究。

近年来，海洋天然产物的开发应用已经成为研究的热点，海洋无脊椎动物已经被证实是众多药源化合物的主要来源。海星资源丰富，在中国渤海、黄海海域均有广泛分布，其含有的活性成分具有抗癌、抗病毒、降血压和抗氧化等多种生理功能，在人类肿瘤治疗及心血管疾病等方面发挥了不可替代的作用，应用前景十分广阔。目前，尚未对多棘海盘车进行有效利用，原因是对其所具有的成分没有完全认识。本研究中发现的4个化合物分别属于鞘脂糖苷类化合物 (化合物1)、甾体类化合物 (化合物2、3)和脂肪酸类化合物 (化合物4)。这些发现将为多棘海盘车的开发利用提供重要的基础数据。

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