MALDI-TOF-MS在鉴定进口甲鱼卵病原菌中的应用

，，， ，，，

（1.厦门出入境检验检疫局，福建厦门 361012；2.集美大学生物工程学院，福建厦门 361021；3.厦门市农产品质量安全检验测试中心，福建厦门 361000）

MALDI-TOF-MS在鉴定进口甲鱼卵病原菌中的应用

徐淑菲1，吴玉娟2，孔繁德1，赵冉3，彭小莉1，叶妍妍1，陈信忠1

（1.厦门出入境检验检疫局，福建厦门 361012；2.集美大学生物工程学院，福建厦门 361021；3.厦门市农产品质量安全检验测试中心，福建厦门 361000）

目的应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）仪器和Biotyper分析软件对台湾进口的甲鱼卵进行携带病原菌的检测。方法 选用合适的培养基对进境甲鱼卵进行细菌分离培养，选取可疑菌株，纯化后接种肉汤培养，然后按照MALDI-TOF-MS要求进行样品制备，点靶并获取样品质谱图，并运用Biotyper分析软件对所获取的质谱图进行分析。同时用全自动微生物鉴定系统进行辅助分析鉴定。结果 应用MALDITOF-MS方法从台湾输入大陆的73批甲鱼卵中分离出绿脓杆菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯氏菌、霍乱弧菌、沙门氏菌等25个属49个种242株致病菌，其中大部分是对人和动物的条件致病菌。结论 当前进境甲鱼卵携带病原菌形势严峻，需引起进出口商、检验机构及其他相关部门重视。本研究对规范甲鱼卵贸易、保障人民健康都有着重要的作用。

甲鱼卵；MALDI-TOF-MS；质谱图；病原菌

甲鱼是一种深受广大消费者欢迎的水产品，已被列入中国国家林业局2000年8月1日发布的《国家保护的有益的或者有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物名录》。甲鱼肉不但是滋补珍品，也是一种用途很广的滋补药品。据台湾甲鱼养殖协会估计，目前大陆每年要消费五六亿只甲鱼，平均每两个人吃掉一只[1]。尽管国内甲鱼养殖业迅速发展，但远远不能满足市场需求，仍然以进口外来甲鱼卵孵化苗种为主，6成来自台湾，台湾成为大陆引进甲鱼卵的主要地区。厦门口岸作为大陆距离台湾最近的口岸，有着得天独厚的地理优势。2006年以来进口的台湾甲鱼卵由零起步到进入正常化、常态化、规模化，实现了“三级跳”[2]，台湾年产5亿粒甲鱼卵，有八成输往大陆孵化成甲鱼，而厦门口岸进口台湾甲鱼卵的进口量占台湾产量三成，厦门口岸已成为台湾甲鱼卵销往内地的首要集散地。厦门口岸在两岸的甲鱼卵贸易中有着举足轻重的作用。

质谱分析法不仅可以用于化学分析，也可以用于生物分析。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption/ ionization time-offight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱。作者曾用此方法对从厦门口岸入境的甲鱼卵样品进行过初步检测，检出绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌等多种病原菌[3]。由于当时样品有限，只能对甲鱼卵携带致病菌进行初步的研究，本文将继续对台湾进口的甲鱼卵进行致病菌检测，在前期工作的基础上进一步探讨甲鱼卵携带致病菌的情况。

1 材料与方法

1.1 试剂

1.1.1 培养基 营养肉汤、肠道增菌液、缓冲蛋白胨水（BPW）、氯化镁孔雀绿肉汤（MM）、四硫磺酸钠煌绿（TTB）、碱性蛋白胨水（APW）、7.5%氯化钠肉汤、李氏增菌肉汤FB、营养琼脂、麦康凯琼脂、硫酸铋（BS）琼脂、HE琼脂、TCBS琼脂、庆大霉素琼脂、血平板、PALCAM琼脂等培养基购自北京陆桥技术有限公司；弧菌显色培养基及李斯特菌显色培养基购自博赛科玛嘉微生物技术有限公司。

1.1.2 其他主要试剂和仪器 无水乙醇，分析纯，购自厦门绿茵化玻有限公司； 甲酸、乙腈、三氟乙酸、α-氰基-4-羟基肉桂酸（alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA），质谱纯，购自BRUKER DALTONICS公司；质量矫正标准品Bacterial Test Standard购自BRUKER DALTONICS公司；革兰氏阴性/阳性细菌鉴定卡为美国Biomerieux公司产品。

主要仪器：高通量微生物鉴定仪，型号为Mtcrofex LRF20，生产厂家为BRUKER DALTONICS；全自动微生物鉴定系统，型号为Vitek 2 compact，生产厂家为生物梅里埃公司。

1.2 方法

1.2.1 实验材料 台湾输入甲鱼卵共73批，取同批样品10～20枚左右甲鱼卵，无菌环境中匀浆破碎，作为细菌分析材料。

1.2.2 细菌分离培养及待检菌前处理 按照徐淑菲等介绍的方法进行[3]。

1.2.3 基质和BTS标准品的配制 标准溶液：50%乙腈，2.5%TFA和47.5%超纯水。基质（α-氰基-4-羟基肉桂酸，CHCA）：用100µL标准溶液溶解CHCA，剧烈震荡后12000r/min离心2 min，4℃保存备用。标准品：用50µL标准溶液溶解Bacterial test standard（BTS）标准品，反复吹打混匀，注意避免出现气泡，静置5 min后再吹打不少于20次，12000 r/min离心2 min，取上清分装，每管5µL，置-20℃保存备用。

1.2.4 点靶 先吸取1µL上清或BTS标准品点靶，自然放干后再点1µL基质，基质干燥后上机，自动抽真空。

1.2.5 质谱检测

1.2.5.1 校准 用BTS标准品进行校正，将Err/ ppm控制在±500以内。

1.2.5.2 质谱仪参数设置 加速电压20kV；质量范围2000-20000Da；激光点击数，每图谱100。

1.2.5.3 细菌蛋白质质谱峰的采集、软件分析按照徐淑菲等介绍的方法进行[3]。

1.2.6 全自动微生物鉴定系统进行对比鉴定 根据仪器说明，使用全自动微生物鉴定系统（Vitek 2 compact）将分离的菌株进行鉴定。

2 结果

2.1 采集细菌的质谱数据并进行分析

打开Biotyper分析软件，调入选中样品数据进行分析（以6#样品中分离到的肺炎克雷伯氏菌为例）。结果判定标准按照徐淑菲等介绍的方法进行[3]。图1是6#样品分离到的肺炎克雷伯氏菌菌株的指纹图谱和细菌库中Klebsiela pneumoniae ssp pneumoniae 9295_1CHB标准菌株指纹图谱的对照图，横线以上是样品的指纹图，由多条特异的蛋白质质谱峰组成，横线以下是数据库中标准菌株的蛋白质质谱峰。样品指纹图谱与标准图谱成镜像关系的比率越大则鉴定为该菌株的可能性就越大。图2是鉴定结果分值，由高到低进行排序，一般由得分最高的进行分离菌株的判定。最高得分为2.526，在2.3- 3之间，判定为肺炎克雷伯氏菌。图3是6#样品分离到的肺炎克雷伯氏菌菌株的特征性的质谱峰峰值，具有较强信号的质谱峰的m/z分别为2691.935、4365.396、5383.210、6290.994、7705.268、9477.070、10284.970、11874.806。

图1 6#样品分离的一株细菌，最高得分为2.526的质谱对照图

图2 鉴定结果分值

图3 6#样品分离到的肺炎克雷伯氏菌的质谱峰

采用徐淑菲等[3]介绍的方法进行细菌分离和培养，从HE、BS、TCBS、麦康凯琼脂、庆大霉素琼脂、血平板、PALCAM、营养琼脂上共分离到601株可疑菌，纯化培养后，获取可疑菌的蛋白质指纹图谱，在软件已有的3290株微生物指纹图谱数据库以及本室自建的281株细菌的蛋白质指纹图谱数据库中进行检索，并分析结果。

分离到的601株细菌的蛋白质指纹图谱，经BioTyper软件分析鉴定，其中502株有鉴定结果（即Score≥2）。由于有些细菌在多种培养基上均可能生长，本研究中用不同培养基从同一个样品中分离到的同一种菌只计算一次，最终共分离到242株细菌，分布于25个属49个种，菌种类别分布较广，其中大部分分离菌株为条件致病菌，可引起人和甲鱼致病，如柠檬酸杆菌、苍白杆菌、雷氏普罗威登斯菌、变形杆菌、副溶血弧菌等。分离到最多的细菌是绿脓杆菌30株，占12.4%，其次为粪产碱杆菌、弗氏枸橼酸杆菌和阴沟肠杆菌，分别为27株、23株、22株，占分离菌的11.2%、9.5%、9.1%（表1）。

2.2 全自动微生物鉴定系统鉴定结果

经MALDI-TOF-MS鉴定的菌株进行全自动微生物鉴定，溶藻弧菌、副溶血弧菌、弗氏枸橼酸杆菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、雷氏普罗威登斯菌、产酸克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、霍乱弧菌、沙门氏菌、无害李斯特菌等细菌的鉴定结果均与全自动微生物鉴定结果相吻合。而其他的一些细菌菌株通过全自动微生物鉴定仪检测结果低于90%，或者根本无法鉴定，出现“Low Discrimination”的提示。

表1 分离菌的MALDI-TOF-MS鉴定结果

3 讨论

3.1 甲鱼卵多重带菌情况

73批样品中有7批未分离到病原菌，带菌率为90.41%（66/73），单重带菌率为15.07%（11/73），其余55批样品都是多重带菌，多重带菌率高达75.34%（55/73）。其中携带2种菌的样品有14批，占19.18%（14/73），比例最高；其次是带4种菌的样品，有11份，占15.07%（11/73）；携带3种菌的样品有10批，占12.12%（10/73）；携带5种菌的样品有7批，占9.59%（7/73）；带6种菌的样品有6批，占8.22%（6/73），另外携带7种、8种、9种细菌的样品分别为3批、1批、2批；2号样品携带细菌种类最多，达12种。由此可知，大部分样品都是多重带菌，带菌情况不仅普遍而且非常严重。

3.2 分离菌株无鉴定结果的情况

本试验分离的菌株除了上述有鉴定结果的菌株外，还有一部分无法鉴定的菌株。这些菌株经过反复纯化后，无论是MALDI-TOF-MS，还是全自动微生物鉴定系统依然不能给出鉴定结果。其原因可能有以下几点：⑴分离到的菌株常常被研究人员忽略；⑵分离到的菌株对动植物及人类的危害小，未引起研究人员的重视；⑶MALDI-TOF-MS及全自动微生物鉴定系统的原始数据库里没有包含该菌的质谱图；⑷分离到的菌株无特异的蛋白质质谱峰。

3.3 MALDI-TOF-MS及全自动微生物鉴定系统鉴定结果符合率

MALDI-TOF-MS和全自动微生物鉴定系统，前者通过对被测样品离子的质荷比的测定来进行分析的一种分析方法[4]，主要针对菌体内高丰度、持续表达的蛋白质，建立蛋白质指纹图谱，从而实现细菌的鉴定，目前数据库可进行2185种细菌的鉴定，并且可以自己建立已知菌的数据库，进一步完善数据库；后者是根据生化介质中指示剂的显色（或浊度）反应而进行细菌的鉴定，目前数据库可进行506种细菌的鉴定。在两者的鉴定范围内，鉴定结果是一致的。这两种鉴定方法，大多数细菌只能鉴定到种。

本文前面提到有些菌株经全自动微生物鉴定系统无法判定，如坦氏不动杆菌（Acinetobacter tandoii）、蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）、中间苍白杆菌（Ochrobactrum intermedium）、小麦苍白杆菌（Ochrobactrum tritici）、膝行假单胞菌（Pseudomonas geniculate）、摩氏假单胞菌（Pseudomonas mosselii）、食油假单胞菌（Pseudomonas oleovorans）、痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae）等，这些细菌均不在全自动微生物鉴定系统的数据库里，因而也就无法鉴定。

3.4 影响MALDI-TOF MS的因素

MALDI-TOF MS是依赖仪器的生物化学分析技术，仪器的精准度、样品的处理方法、基质的选择以及一些人为因素对结果产生直接的影响，如培养基[5]、培养时间[6]、细菌前处理[7]、点样误差、激光能量、基质峰等等。

3.5 MALDI-TOF-MS在国内外的应用情况

飞行时间质谱的应用范围较其他质谱仪更广，可以进行多种有机物及无机物的定性和定量分析、复杂化合物的结构分析、样品中各种同位素比的测定及固体表面的结构和组成分析等，并且是近年兴起的蛋白质组学研究前沿技术。国内外将此技术广泛应用于医学等各个领域。杜宗敏等研究人员用MALDI-TOF-MS方法进行了金黄色葡萄球菌、沙门菌、宋内志贺氏菌、单增李斯特菌、厌氧菌的鉴定以及癌症的诊断[8-19]，均取得了较好的分析鉴定结果。

3.6 通过MALDI-TOF-MS和BioTyper分析软件对甲鱼卵携带微生物进行鉴定

目前市场上的甲鱼大部分都是由人工养殖的，由于人工养殖甲鱼的密度大，极易发生群体性细菌感染，用于孵化的甲鱼卵的质量直接影响到甲鱼的健康。甲鱼卵本身携带病原菌，就极可能在存放、运输及孵化的过程中使病原菌大量繁殖，使幼鳖患病，甲鱼卵作为可食用的食品也会引起人类食物中毒。因此对于甲鱼卵要进行严格的质量检验，以保证养鳖业健康发展和人们的身体健康，本研究针对台湾进口的73批1000多粒甲鱼卵进行了带菌情况分析，结果发现甲鱼卵有90.41%携带常见细菌，所携带细菌可归类为25个属49种，其中大部分为人类条件致病菌，它们广泛存在于环境中，当环境条件改变时也可引起人类疾病，导致腹泻、呕吐等，同时还分离到了沙门氏菌等致病菌。每份样品携带细菌的数量不等，但大部分为多重带菌，最多的同时携带了12种菌。这表明甲鱼卵携带病原菌范围广，种类多，多重带菌现象严重，这可能与甲鱼卵的生长环境及运输过程中的条件有关。本试验分离出这些病原菌对于加强进口甲鱼卵的监管具有重要的警示意义，对于促进两岸甲鱼卵进口，规范甲鱼卵市场，保障人民健康都有着重要的作用。

[1] 郑石勤.台湾生大陆养两岸连手打造甲鱼养殖业 [J] .养鱼世界，2011（8）.

[2]何祖谋，严建华.厦门口岸成为台湾甲鱼卵销往大陆的首要集散地[EB/OL].（2009-10-30）.http：//district.ce.cn/ zg/200911/06/t20091106_20362936.shtml.

[3] 徐淑菲，孔繁德. MALDI Biotyper高通量微生物鉴定系统在台湾进口鳖蛋检疫中的初步应用[J]. 检验检疫学刊，2011（1）：28-32.

[4]其布勒哈斯，田世民，邹明强. MALDI-TOF质谱技术分析与鉴定病原细菌研究[J]. 微生物学通报，2009（3）：416-426.

[5] Holland R D，Duffy C R，Rafi R，et a1. Identifcation of bacterial proteins observed in MALDI TOF mass spectra from whole cells[J]. Anal Chem，l999，71（15）：3226-3230.

[6]Arnold RJ，Karty JA，Ellington AD，et a1. Monitoring the Growth of a Bacteria Culture by MALDI-MS of Whole Cells[J].Anal Chem，l999，71（10）：1990-1996.

[7] Ryzhov V，Hathout Y，Fenselau C，et a1. Rapid Characterization of Spores of Bacillus cereus Group Bacteria by Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry[J] .Appl Environ Microbiol，2000，66（9）：3828-3834.

[8]泓海，邹汉法.固定化酶微升反应器与MALDI-TOF-MS联用技术用于蛋白质肽谱[J].中国科学：B辑，2000（5）：385-391.

[9]杜宗敏，杨瑞馥，郭兆彪，等.金黄色葡萄球菌及其甲氧苯青霉素耐药性的MALDI—TOF MS鉴定[J] . 分析测试学报，2003（1）：62-67.

[10]石桂英，孙宗科，陈西平.应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测细菌耐药性的初步研究[J] .卫生研究，2008（1）：82-85.

[11]战晓微，傅俊范，郑秋月，等. 沙门氏菌MALDI-TOFMS检测方法的建立[J]. 现代食品科技，2011，27（5）：595-597.

[12]鲍春梅，崔恩博，陈鹏，等. MALDI-TOF-MS鉴定宋内志贺菌的初步应用研究[J]. 传染病信息，2012，25（1）：10-13.

[13]王耀，曹际娟，赵昕，等.单增李斯特氏菌MALDITOF-MS鉴定与分型研究[J]. 食品科学，2012，33（3）：194-198.

[14] de Noo M E，Deelder A，Werff A et al. MALDI-TOF Serum Protein Profling for the Detection of Breast Cancer[J]. Onkologie，2006，29（11）；501-506.

[15] de Noo M E，Mertens BJA，Ozalp A，et al. Detection of colorectal cancer using MALDI-TOF serum protein profling[J]. Eur J Cancer，2006，42（8）：1068-1076.

[16] Dallagassa C B，Huergo L F，Stets M I，et al.Matrixassisted laser desorption ionization-time of fight mass spectrometry analysis of Escherichia coli categories[J]. Genet Mol Res，2014，13（1）：716-722.

[17] Rodrigo M M A，Zitka O，Krizkova S，et al. MALDITOF MS as evolving cancer diagnostic tool：A review[J].J Pharm Biomed Anal，2014，95：245-255

[18] Usbeck J C，Wilde C，Bertrand D，etc. Wine yeast typing by MALDI-TOF MS[J].Appl Microbiol Biotechnol，2014，98（8）：3737-3752.

[19] Hsu YMS，Burnham CAD. MALDI-TOF MS identification of anaerobic bacteria：assessment of pre-analytical variables and specimen preparation techniques[J].Diagn Microbiol Infect Dis，2014，79（2）；144-148.

Application of MALDI-TOF-MS for Identifcation of Pathogenic Bacteria in Imported Terrapin Eggs

Xu Shufei1，Wu Yujuan2，Kong Fande1，Zhao Ran3，Peng Xiaoli1，Ye Yanyan1，Chen Xinzhong1

Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Xiamen，Fujian 361012； 2. Biological Engineering Institute of Jimei University，Xiamen，Fujian 361021；3. Xiamen Agriculture Product Quality and Safety Test Centre，Xiamen，Fujian 361000）

ObjectiveMatrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry（MALDI-TOFMS）instrument and the Biotyper analysis software was applied to investigate the pathogens carried in terrapin eggs from Taiwan.MethodsSuitable media for the bacteria isolation and culture of the imported soft-shell turtle eggs were chosen，and suspicious bacterial strains were cultured，isolated and purifed，and then inoculated into broth. After being cultured in broth，the probable pathogens were prepared and added to the target polished steel plate and the mass spectra were acquired. The spectra were analyzed by the Biotyper analysis software. And automatic bacteria identifcation system was used to aid the analysis and identifcation of the pathogens.Results242 bacteria strains in 49 species of 25 genera were isolated from the 73 lots of terrapin eggs from Taiwan by MALDI-TOF-MS，including Pseudomonas aeruginosa，Proteus mirabilis，Klebsiella pneumoniae，Salmonella，Vibrio cholera and most of them were opportunistic pathogens both for human and animals.ConclusionIt was shown that the current situation of the imported terrapin eggs carrying pathogenic bacteria was serious，and the exporter or importer，the inspection organs and the other relevant departments are required to pay more attention to it. The study will play an important role in promoting the terrapin egg trade and protecting the public health.

terrapin egg； MALDI-TOF-MS； mass spectrum； pathogenic bacteria

S851.347；S947.12

B 文章编号：1005-944X（2014）07-0086-06

厦门市科技计划项目（项目编号：3502Z20124003）

徐淑菲