超声波辅助提取鱼脑磷脂的研究

张丽，卢航，刘迪，刘鹏宇，朱瑶，胡建恩

(大连海洋大学 食品科学与工程学院，辽宁 大连116023)

鲣是金枪鱼的一种，也是金枪鱼类资源最丰富的鱼种，年渔获量几乎占全世界金枪鱼类渔获量的50%，约150 万t［1］。鲣主要被加工成罐头，在其加工过程中，产生的副产物大约占体质量的50% ～70%［2］，鱼头占副产物的比例较大，鱼脑作为鱼头的一部分，除含有蛋白质外，还含有丰富的磷脂，是可利用的磷脂资源。磷脂是含磷酸基团的类脂化合物，主要存在于植物种子以及动物的脑、肝、卵中，是细胞膜结构的主要组成部分，具有调节膜酶活性、改善脂质代谢等生理功能［3-4］。磷脂还具有乳化作用，已被广泛应用于食品、药品、皮革加工等行业［5］。本研究中，对超声波辅助提取鱼脑磷脂的提取效率进行了研究，以期为鱼产品加工副产物中鱼脑的高值化利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用鲣鱼脑取自山东靖海实业有限公司水产品加工厂。

磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、神经鞘磷脂(SM)、溶血卵磷脂(LPC)标准品，均购于美国Sigma 公司;硅胶GF254 薄层层析板(10×20 cm)，购于青岛海洋化工公司;乙醇、正己烷等其他试剂均为分析纯。

仪器有超声波发生器(KJ-600)、气相色谱仪(GC-2010)、紫外可见光分光光度计(721 型)。

1.2 方法

1.2.1 超声法提取磷脂的试验流程 鱼脑解冻破碎→正己烷-乙醇超声提取→抽滤→磷脂萃取液→浓缩→冷丙酮提纯→沉淀(磷脂)。

1.2.2 超声法提取鱼脑磷脂的试验设计在恒定功率300 W 下，采用正己烷-乙醇混合溶剂提取鱼脑中的磷脂。以溶剂混合比、固液比、超声时间、超声温度和超声提取次数作为影响因素进行单因素试验，然后进行正交试验优化磷脂提取工艺条件。

1.2.3 氯仿-甲醇法提取磷脂 参照文献［6］中的方法，用氯仿-甲醇法提取鱼脑磷脂，因磷脂不溶于丙酮，故对提取的鱼脑总脂肪用丙酮洗涤，获取的不溶物即为粗磷脂。试验步骤为:鱼脑经解冻匀浆后称取10 g，在氯仿-甲醇溶剂中萃取，收集下层氯仿层，于38 ℃下真空浓缩后的样液，经冷丙酮反复洗涤至无色，收集沉淀即为磷脂样品。

1.2.4 磷脂含量的测定和相对提取率的计算 参照GB/T 5537—2008 《粮油检验:磷脂含量的测定》中的方法进行分析测定。

相对提取率(K)的计算公式为

1.2.5 磷脂的定性分析 用氯仿溶解磷脂标准品配成1 mg/mL 溶液，将标准品与样品点于同一硅胶GF254 薄层层析板上，在层析液(φ(氯仿)∶φ(甲醇)∶φ(水)=65∶25∶4)中展开，展距10 cm，用碘蒸气显色，通过比较样品与标准品的比移值(Rf)，来确定样品中磷脂的组成成分。

1.2.6 脂肪酸分析 制取的鱼脑磷脂采用三氟化硼法甲酯化［7］后，参照《GB/T 17377—2008 动植物油脂脂肪酸甲脂的气相色谱分析》中的方法进行气相色谱分析。

2 结果与讨论

2.1 用超声法提取鲣鱼脑磷脂条件的单因素试验

2.1.1 提取溶剂 一般非极性溶剂适合于溶解游离态的脂类，对结合态的脂类提取效率不高。天然产物中磷脂常与蛋白结合［8］，为此，本试验中选用混合溶剂进行提取，其优势在于极性溶剂乙醇的加入可以破坏磷脂和蛋白质的结合，提高磷脂的得率。在提取温度为35 ℃、超声提取时间为30 min、固液比(均为g∶mL)为1∶5、超声辅助提取一次的条件下，正己烷与乙醇的不同配比对磷脂提取率的影响如图1所示。从图1可见，磷脂的提取率随着正己烷与乙醇配比的改变呈先升高后降低的趋势，当正己烷与乙醇溶剂的体积比为3∶1、2∶1、1∶1时，相对提取率分别为35.5%、51.6%和32.2%。因此，本试验条件下，选用正己烷与乙醇的溶剂比为2∶1 时，磷脂提取效果最好。

2.1.2 提取时间在正己烷与乙醇的溶剂比为2∶1、温度为35 ℃、提取时间为30 min、固液比为1∶5、超声波辅助提取一次的条件下，不同提取时间对磷脂提取率的影响如图1所示。从图1可见，磷脂相对提取率随着提取时间的延长逐渐升高，而当提取时间为40 ～70 min 时，相对提取率的增加趋势变缓。因此，在本试验条件下，提取时间选择40 min 时，磷脂提取效果较好。

2.1.3 固液比在正己烷与乙醇的溶剂比为2∶1、温度为35 ℃、超声时间为40 min、超声提取一次的条件下，不同固液比对磷脂提取率的影响如图1所示。从图1可见:磷脂相对提取率随着固液比的增大呈上升趋势。当固液比为1∶9 时，相对提取率达到74.1%;当固液比增大到1∶11 时，提取率变化不大。因此，本试验条件下，选择固液比为1∶9时，既能节约溶剂又能保证磷脂提取效果。

图1 正己烷与乙醇的配比、超声提取时间、固液比、温度、超声提取次数对磷脂提取率的影响Fig.1 Effect of n-hexane/ethanol ratio，ultrasonic extractive time，solid-liquid ratio，temperature，and ultrasonic frequency on the extraction rate of the phospholipids

2.1.4 温度在正己烷与乙醇的溶剂比为2∶1、超声时间为40 min、固液比为1∶9、超声提取一次的条件下，不同温度对磷脂提取率的影响如图1所示。从图1可见，温度为15 ～35 ℃时，磷脂的相对提取率随温度的升高逐渐增加，由48.4%增加到78.1%，当温度继续升高时，磷脂的相对提取率却逐渐下降。有研究表明，温度升高使分子动能增加，从而提高萃取效率，但温度过高时又会使卵磷脂氧化降解，磷脂含量降低［8］。因此，本试验条件下，选择温度为35 ℃时磷脂提取效果最好。

2.1.5 超声提取次数在正己烷与乙醇的溶剂比为2∶1、超声时间为40 min、固液比为1∶9、温度为35 ℃的条件下，超声提取次数对鱼脑磷脂提取率的影响如图1所示。从图1可见，磷脂提取率随超声提取次数的增加而增加，但超声提取3次与2次相比，磷脂提取率的变化不大。因此，本试验条件下，选择超声提取次数为2 时，磷脂提取效果较好。

2.2 超声提取法的正交试验设计

根据单因素试验结果，选择在恒定功率为300 W，超声提取2次的条件下，以混合溶剂配比、超声提取时间、固液比和温度为因素，以磷脂相对提取率为指标，按L9(34)进行正交试验设计，因素水平表如表1所示。

表1 因素水平表Tab.1 The table of factors and levels

表2 磷脂提取正交试验设计方案与结果Tab.2 Results and analysis in the orthogonal experiment of phospholipids

由极差分析结果表明:用超声法提取鱼脑磷脂的过程中，溶剂配比对磷脂的提取率影响最大，各因素对提取效果的影响程度依次为溶剂配比、提取时间、固液比、提取温度，最佳试验组合为A3B2C2D3，即当超声功率为300 W、正己烷与乙醇的溶剂比为2∶1、超声提取时间为40 min、固液比为1∶9、温度为35 ℃、超声提取2次的最优工艺条件下，磷脂的提取率最高。在此最优工艺条件下进行验证试验，可从每克鱼脑中(湿质量)中提取得到19.59 mg 磷脂，与氯仿-甲醇法(22.49 mg)相比，磷脂的相对提取率达到87.1%。由于氯仿、甲醇的毒性较高，具有损伤眼膜和致癌的作用，而本试验中选用正己烷与乙醇，在保证一定提取效率的前提下，又相对降低了溶剂的毒性，是较为安全有效的磷脂提取方法，可以替代氯仿-甲醇法提取磷脂。

2.3 鲣鱼脑磷脂的组分分析

从超声提取的鲣鱼脑磷脂与磷脂标准品的薄层色谱图(图2)可知，鲣鱼脑中含有4种磷脂成分，对照比移值可知其中3种为PE、PC、SM，第四点(X)未能确定其成分，依据文献［9］报道，推测X 点可能为磷脂酰甘油(PG)。此外PE、PC 所对应的斑点面积较大，分析其中PE和PC 含量相对较高。

图2 鲣鱼脑磷脂薄层色谱图Fig.2 Thin-layer chromatogram of phospholipids extracted from Skipjack brain

2.4 鲣鱼脑磷脂的脂肪酸组成分析

通过气相色谱分析了鲣鱼脑中磷脂的脂肪酸组成。从表3可见:鲣鱼脑中磷脂的脂肪酸主要由C16∶0、C18∶0、C18∶1n9c、C20∶5n3、C22∶6n3构 成，且DHA(二十二碳六烯酸)和EPA(二十碳五烯酸)含量分别为21.1%和2.4%，说明鲣鱼脑中有较高含量的富含DHA、EPA 的磷脂存在。而大豆和蛋黄磷脂的脂肪酸主要由C16∶0、C18∶1、C18∶2构成，不含DHA和EPA［10］。有研究表明，海参磷脂的不饱和度远大于大豆磷脂，对小白鼠增强脂肪代谢和控制糖代谢方面的效果也优于大豆磷脂，可以明显抑制小白鼠体质量的增长［11］。所以，鱼脑磷脂的利用价值应高于目前一般使用的大豆和蛋黄磷脂。

表3 鲣鱼脑磷脂的脂肪酸组成Tab.3 The fatty acid composition of phospholipids from skipjack brain

3 结语

超声波辅助提取是一个物理提取过程，其优点在于此过程中无化学反应发生，提取物的生物活性相对稳定［12］。本试验中将超声技术应用于鲣鱼脑磷脂的提取，结果表明，该法提取磷脂具有可行性。通过薄层色谱分析，确定鲣鱼脑中含有PE、PC、SM，还可能含有PG。

目前，国内外对大豆和蛋黄磷脂的研究居多，对海洋磷脂的研究相对较少。比较鲣鱼脑磷脂、大豆和蛋黄磷脂的脂肪酸组成，发现鲣鱼脑磷脂中含有更丰富的DHA和EPA，可能比大豆磷脂和蛋黄磷脂具有更丰富的生物活性。用超声法提取鲣鱼脑磷脂的研究，既为有效地利用鲣鱼头资源提供科学依据，也为海洋磷脂的开发提供了新思路。

［1］胡家辉.中国金枪鱼业发展研究［D］.上海:上海水产大学，2007.

［2］Luis A V，Ernesto A，Angela A.Silage preparation from tuna fish wastes and its nutritional evaluation in broilers［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，1999，79:1915-1922.

［3］曹栋，裘爱泳，王兴国.磷脂的结构、性质、功能及研究现状(2)［J］.粮食与油脂，2004(6):13-16.

［4］Hayashi H，Tanaka Y，Hibino H，et al.Beneficial effect of salmon roe phosphatidylcholine in chronic liver disease［J］.Current Medical Research and Opinion，1999，15(3):177-184.

［5］Nii T，Ishii F.Dialkylphosphatidylcholine and egg yolk lecithin for emulsification of various triglycerides［J］.Colloids Surf B Biointerfaces，2005，41(4):305-311.

［6］Folch J，Lees M，Sloane S G H.A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues［J］.Journal Biological Chemistry，1957，226:497-509.

［7］陈炜，王保刚，李晓东，等.从小球藻中提取和富集多不饱和脂肪酸的研究［J］.大连海洋大学学报，2010，25(3):275-280.

［8］边晶晶，谢晶，陈舜胜.南美白对虾虾头中磷脂提取工艺的优化［J］.食品科学，2011，32(24):11-15.

［9］吴世芳.何首乌中磷脂类化合物的提取、分离及分析方法研究［D］.南昌:南昌大学，2007.

［10］林洪，江洁，许加超，等.贻贝磷脂与大豆磷脂卵黄磷脂组成的比较研究［J］.营养学报，2002，24(1):87-89.

［11］楼桥明.几种海产动物脂质分析及海参EPA 生理活性研究［D］.青岛:中国海洋大学，2011.

［12］李敏晶，韩艳玲，谭成玉，等.不同提取方法对海燕皂苷抗氧化活性的影响［J］.大连海洋大学学报，2011，26(4):344-347.