高效液相色谱柱后衍生法测定中药材中的黄曲霉毒素

王娅玲，李维峰，刘 宝，刘 香，何维红

（1.云南热带作物职业学院热带作物生产与技术系，云南普洱 665000；2.普洱淞茂制药股份有限公司，云南普洱 665000）

高效液相色谱柱后衍生法测定中药材中的黄曲霉毒素

王娅玲1，李维峰1，刘 宝2，刘 香2，何维红2

（1.云南热带作物职业学院热带作物生产与技术系，云南普洱 665000；2.普洱淞茂制药股份有限公司，云南普洱 665000）

检测普洱城区僵蚕、陈皮、桃仁、胖大海4种中药材的黄曲霉毒素，了解其污染状况。样品经70%甲醇提取、免疫亲和柱净化后，用HPLC-柱后衍生-荧光检测器进行分析测定药材中的黄曲霉毒素（G2、G1、B2、B1）含量。检测的80个样品中，共有7个样品检出黄曲霉毒素，黄曲霉毒素B1的含量最高为1.89μg／kg，黄曲霉毒素总量最高为3.57μg／kg。尽管未超出国家药典规定范围，但是普洱城区4种中药材存在一定的黄曲霉毒素污染的风险。

僵蚕；陈皮；桃仁；胖大海；黄曲霉毒素；高效液相色谱柱后衍生法

黄曲霉毒素，是黄曲霉、寄生曲霉及温特曲霉等产毒株的代谢产物，是一类结构类似的化合物［1］。黄曲霉毒素是剧毒化合物，其毒性比氰化钾还高，也是最强的化学致癌物质［2］。黄曲霉毒素主要污染粮油及其制品，而部分中药材及其制剂在储存过程中也会发生霉变，产生黄曲霉毒素［3］。2010版《中国药典》一部规定陈皮、胖大海、桃仁、僵蚕等中药材需检测黄曲霉毒素，其中黄曲霉毒素B1的限量为5μg／kg，黄曲霉毒素（B1＋B2＋G1＋G2）的限量为10μg／kg。黄曲霉毒素的检测有多种方法，目前应用较多的是高效液相色谱法［4，5］。笔者通过对普洱城区市场上上述4种中药材抽样进行黄曲霉毒素检测，以期评估当前普洱市场上这4种药材存在的黄曲霉毒素污染风险。

1 仪器、试剂与药材

主要仪器：LC200／UV高效液相色谱仪（美国PE）；荧光检测器；柱后衍生系统Vector PCX（美国Ameritech）；国华HY-3数显多功能振荡器；电子分析天平（上海奥豪斯贸易有限公司）；纯水／超纯水系统（韩国HUMAN PowerI）。

主要试剂：甲醇（AR，上海国药）；甲醇（色谱纯，德国MERCK）；乙腈（色谱纯，德国MERCK）；碘（AR，上海国药）；超纯水；黄曲霉总量免疫亲和柱ToxinFast®AFT HCM0125（华安麦科），黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合对照品（美国supelco公司，批号：46304-U，质量浓度依次为1μg／m L、7.5 μg／m L、1μg／m L、0.3μg／mL）。

僵蚕、陈皮、桃仁、胖大海样品其中各有5份由普洱松茂制药股份有限公司提供，其余各从普洱城区药材市场采购15份，共得到样品80份。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱为Agilent Lichrosper C18（4.6 mm× 250mm，5μm），流动相为甲醇-乙腈-水（1∶1∶2），流速0.8 mL／min；柱后衍生试剂为0.05%的碘液，衍生试剂流速0.3mL／min，反应温度70℃，以荧光检测器检测，激发波长为360 nm，发射波长为450 nm；柱温20℃；运行时间为35min。

2.2 待测溶液的制备

对照品溶液：精密量取黄曲霉毒素混合溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，作为混合对照品储备液；然后精密量取上述储备液1mL，置于25 mL容量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，摇匀，即得到混合对照品溶液（黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2质量浓度依次为4 ng／mL、30 ng／mL、4 ng／mL、1.2 ng／mL）。

样品溶液：取适量样品粉碎，过2号筛，精确称取样品25 g，置于250 mL具塞锥形瓶，加入氯化钠5 g，加70%甲醇125mL，盖好塞子，在振荡器上高速震荡25 min，震荡完毕，静置20 min，精密移取10 m L上清液于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀。将上述溶液用微孔滤头（0.22 μm）过滤，取10 mL滤液过黄曲霉毒素免疫亲和柱，流速控制1～2滴／s，待滤液全部通过免疫亲和柱，用10mL纯水冲洗免疫亲和柱，流速控制为2～3滴／s，待纯水流净之后加入2 mL甲醇，控制流速为1滴／s，使结合在免疫亲和柱上的黄曲霉毒素冲洗下来，洗脱液直接装入小瓶供检测用。

2.3 方法适用性试验

标准曲线的考察：在前述色谱条件下，用自动进样器分别进样5、10、15、20、25μL，记录色谱图，以黄曲霉毒素进样体积为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，通过软件计算得到回归方程，见表1。

精密度实验：标准对照品溶液，在进样体积10 μL处连续进样6次，结果黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2各峰面积RSD分别为0.3%、0.5%、0.4%、0.5%，表明仪器精密度良好。

表1 黄曲霉毒素的线性回归方程、相关系数及线性范围Table 1 Regression Equation，Correlation Coefficient and Line Range of Aflatoxins

稳定性实验：混合标准对照品溶液，在配制0、5、15、25 h后分别取2010μL进样，每次进样得到的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2各峰面积RSD分别为1.4%、0.8%、1.1%、1.5%，表明对照品溶液在25 h内基本稳定。

回收率实验：称取4种空白药材各3份，分为3组，每组分别加入混合对照储备液1、2、3mL，然后按照前述样品处理方法进行相同处理，制备得到供试品溶液，进样测定黄曲霉毒素含量。计算平均回收率，结果见表2。

表2 加样回收率实验结果（n＝3）Table 2 The Sam p le Added Recovery Determ ination（n＝3）

检出限：在空白样品中加入对照品，按照样品处理流程处理，进样，测定黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的信噪比（S／N），用S／N＝3的计算方法计算检出限，得到黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的检出限分别是0.2μg／kg、0.15μg／kg、0.1μg／kg、0.2μg／kg。

2.4 样品检测

按照前面建立的检测方法测定4种药材，共计80个样品。结果表明，检出率比较低，其中桃仁样品未检出，陈皮检出率为15%，僵蚕检出率为20%，胖大海未检出。检出的样品中，黄曲霉毒素B1的含量最高为1.89μg／kg，黄曲霉毒素总量最高为3.57μg／kg，以国家药典规定限量（黄曲霉毒素B1为5μg／kg，黄曲霉毒素（B1＋B2＋G1＋G2）为10μg／kg）判定，样品合格率为100%。阳性样品结果见表3。

?表3 中药材中黄曲霉毒素阳性结果Table 3 Total positive result of the 4 kinds of T raditional Chinese M edicines from Puer Downtown Areas μg／kg

3 结论

曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构（IARC）划定A组，即“人类致癌物，人们已经对这些毒素在食品中的存在进行了广泛而深入的研究，却对这些毒素在中药中的存在有所忽略。中药材及其制剂在储存过程中经常会发生霉变现象，从而会产生很多对人体有害的霉菌毒素。通过本次分析检测结果显示，由普洱松茂制药股份有限公司提供的5个样品中均未检测到黄曲霉毒素，而在普洱城区市场中采购的样品中僵蚕、陈皮两种中药材存在一定的黄曲霉毒素污染，这与夏季普洱气候比较湿热，小的公司或摊贩贮存条件不当，导致药材发生霉变有关。虽然此次检测结果低于国家限定水平，但是应当引起重视。

［1］ 张爱婷.中药黄曲霉毒素含量测定及限度标准的研究［J］.光明中医，2008，23（11）：1668-1669.

［2］ 杨美华.药用植物及其产品中真菌及真菌毒素污染研究进展［J］.贵州农业科学，2008，36（6）：59-63.

［3］ 刘晓霞，傅武胜，吴锦忠.植物药中黄曲霉毒素现代分析方法概况［J］.海峡预防医学杂志，2010，15（2）：28-31.

［4］ 李军，于一茫，田苗，等.免疫亲和柱净化－柱后光化学衍生－高效液相色谱法同时检测粮谷中的黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A［J］.色谱，2006，24（6）：581-581.

［5］ 郑荣，毛丹，王柯，等.HPLC法测定中药中黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1的含量［J］.药物分析杂志，2005，26（6）：5-8.

Determ ination of A flatoxins in 4 Kinds of Traditional Chinese M edicines in Puer Downtown Areas by HPLC w ith Post－colum n Derivatization

WANG Ya-ling1，L IW ei-feng1，LIU Bao2，LIU Xiang2，HE W ei-hong2

（1.Yunnan Vocational College of Tropical Crops，Puer 665000，China；2.Puer Songmao Pharmaceutical Co.，Ltd，Puer 665000，China）

Objective：To determine aflatoxins in 4 kinds of Traditional Chinese Medicines including Bombyx batryticatus，dried tangerine peel，Persicae Semen，Sterculia lychnophora from Puer Downtown Areas.Method：After being extracted by 70%methanol and purified by immunoaffinity columns，4 aflatoxins（G2，G1，B2，B1）from 80 samples of 4 kinds of Traditional Chinese Medicines were analyzed by HPLC with post－column derivatization and fluorescence detector.Result：The aflatoxinswere found in 5 samples，with positive rate of8.75%in all.The highest content of aflatoxin B1 is1.89μg／kg，and the highest content of aflatoxins is3.57μg／kg。Conclusion：The aflatoxins pollution exists among the 4 kindsof Traditional Chinese Medicines from Puer Downtown Areas，although it is lower than the national standard.

Bombyx batryticatus；dried tangerine peel；Persicae Semen；Sterculia lychnophora；aflatoxins；

R927.11

： A

： 1004-275X（2014）01-0042-03

12.3969／j.issn.1004-275X.2014.01.011

收稿：2013-05-27

王娅玲（1985-），女，云南宣威人，助教，主要从事环境化学和食品化学方面研究。

post－column derivatization