长双歧杆菌α-半乳糖苷酶的分离纯化及酶学性质

陈俊亮，田 芬，霍贵成，张慧芸

（1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471003；2.东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030；3.杭州娃哈哈集团有限公司研究院，浙江 杭州 310018）

α-半乳糖苷酶（α-galactosidase，α-Gal，EC3.2.1.22）属外切糖苷酶类，能够专一性催化非还原末端α-半乳糖苷键的水解[1]，它不仅能够水解含α-半乳糖苷的半乳甘露低聚糖和棉子糖族低聚糖[2-3]，而且能够水解含该键的多糖[3-5]，此外，它还能作用于含有α-半乳糖苷的糖蛋白和糖脂质[6]，因此α-半乳糖苷酶在食品、医药、饲料工业等领域得到广泛的应用[7-9]。在食品行业中，大豆蛋白质是氨基酸平衡模式的典范，但是在豆制品中存在α-半乳糖苷寡糖类物质，由于人的消化系统中缺乏降解此类物质的α-半乳糖苷酶，当这些物质消化经过大肠时，微生物发酵会产生大量气体，从而导致腹胀，因此在豆制品中添加α-半乳糖苷酶可以分解这些寡糖，增加人体对豆类营养成分的吸收[10]。

α-半乳糖苷酶主要来源于微生物、植物和动物，其中微生物的产酶量较高，国内外学者已筛选出多种产α-半乳糖苷酶活性的微生物，主要包括短双歧杆菌、青霉菌、酵母菌、放线菌等[10]。为了能够满足食品加工的要求，开发耐热性α-半乳糖苷酶，寻找高产酶量的微生物成为研究热点。实验以1株产α-半乳糖苷酶长双歧杆菌KLDS2.0509作为研究对象[11]，从酶的pH值稳定性、热稳定性、不同金属离子的影响，以及底物特异性等方面进行研究，为今后开发α-半乳糖苷酶的乳酸菌发酵剂的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

长双歧杆菌KLDS2.0509 乳品科学教育部重点实验室工业微生物菌种保藏中心。

Trypticase peptone-yeast extract（TPY）培养基：酪蛋白胨12 g/L、大豆蛋白胨5 g/L、多聚蛋白胨（polypepton）3 g/L、葡萄糖5 g/L、酵母粉5 g/L、低聚果糖5 g/L、吐温-80 1 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L、K2HPO43H2O 0.2 g/mL、柠檬酸氢二氨0.2g/mL、乙酸钠0.5 g/mL、硫酸镁58 mg/mL、硫酸锰25 mg/mL，pH6.5；蜜二糖、棉子糖、水苏糖、pNPG（p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside）、牛血清白蛋白 美国Sigma公司；酵母粉、蛋白胨 英国Oxiod公司；其余试剂为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

BCN1360型生物洁净工作台 上海佳胜实验设备有限公司；DU800核酸/蛋白质分析仪 美国Beckman公司；SPX-150B生化培养箱 上海智城分析仪器制造有限公司；HIRAYAMA HVE-50型高压灭菌器 日本Hirayama公司；Delta320pH计 瑞士梅特勒-托利多（上海）有限公司；离子交换色谱仪 美国Dionex公司；Simplicity超纯水系统 美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1α-半乳糖苷酶的制备

将菌株KLDS2.0509在TPY培养基中连续两次增殖，体积分数5%活化发酵剂接种于200 mL添加1 g/100 mL葡萄糖和1 g/100 mL棉子糖的TPY肉汤培养基中，在37 ℃条件下厌氧培养48 h。在发酵12、24、36、48 h时分别取样50 mL，以6 000×g离心10 min收集菌体，用20 mL冷的50 mmol/L柠檬酸钠缓冲液（pH 5.5，4 ℃）清洗细胞沉淀，接着6 000×g离心10 min，重复以上清洗操作。然后用10 mL相同的缓冲液悬浮细胞沉淀，放置于冰浴中，超声波处理（间歇破碎80次，工作时间3 s，间隔4 s），最后12 000×g离心30 min除去细胞碎片，上述所有离心操作都在4 ℃进行，上层清液用作天然酶提取物[12]。

1.3.2 酶活力测定

取250 μL酶液与500 μL 5 mmol/L的pNPG混合，在37 ℃温育30 min，添加500 μL的0.2 mol/L碳酸钠终止反应，在400 nm波长测定其OD值，以p-NP的生成量表示酶活力。分别测定不同浓度对硝基苯酚标准品的OD400nm，根据测得的吸光度，绘制标准曲线。

酶活力单位（U/mL）定义为：在测定条件下每分钟每毫升pNPG释放1 μmol的p-NP所需的酶量[13]。

1.3.3 酶的纯化

向粗酶液中加入固体(NH4)2SO4至30%的饱和度，4 ℃盐析10 h，离心除去沉淀；然后取上清液继续加入固体(NH4)2SO4至饱和度为60%，4 ℃放置过夜，离心收集沉淀。将沉淀溶于0.01 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH 6.5）中，然后装入透析袋中，4 ℃透析12 h，每隔3 h更换一次缓冲液；取适量上述透析液加入预先用0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 6.5）平衡过的Sephadex G-100柱中进行洗脱，洗脱速率18 mL/h，分步收集洗脱液，分别测定每管的酶活力。

1.3.4 蛋白质分子质量和浓度的测定

采用LaemmLi法进行SDS-PAGE测定蛋白质分子质量[14]；以牛血清白蛋白为标准，采用Lowry法测定蛋白质含量[15]。

1.3.5α-半乳糖苷酶酶学性质研究

1.3.5.1 酶的最适反应pH值及pH值稳定性

分别用pH 2.0～7.0的0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液和pH 8.0～9.0的0.1 mol/L的Tris/HCl缓冲液配制底物pNPG，将酶液分别加入进行酶促反应，测定酶活力，以确定酶的最适pH值；将酶液在不同pH值的缓冲液中于37 ℃条件下分别处理30 min，测定酶活力以研究酶的pH值稳定性[16]。按照1.3.2节方法测定酶活力，以最高酶活力为100%，计算相对酶活力。

1.3.5.2 酶的最适反应温度及热稳定性

在标准酶促反应体系中，在10～70 ℃温度条件下分别测定酶活力，确定此α-半乳糖苷酶的最适作用温度；然后将该酶在35、40、45、50 ℃条件下进行酶促反应，并分别在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h时测定剩余酶活力[17]。按照1.3.2节方法测定酶活力，以最高酶活力为100%，计算相对酶活力。

1.3.5.3 不同金属离子对酶活力的影响

在酶促反应体系中分别加入金属离子Na+、Ca2+、Fe2+、K+、Li+、Zn2+、Mn2+、Mg2+、Hg2+、Cu2+、Ag+，使金属离子终浓度为1.0 mmol/L，在37 ℃条件下进行酶促反应，以未加入金属离子的酶液做对照，考察金属离子对酶活力的影响[18]。以未处理酶液的酶活力为100%，计算相对酶活力。

1.3.5.4α-半乳糖苷酶的底物特异性测定

将蜜二糖、棉子糖、水苏糖和瓜尔豆胶溶解于0.1mol/L McIlvaine缓冲液（pH 5.0）中，蜜二糖、棉子糖、水苏糖质量浓度各1 mg/mL，瓜尔豆胶为3 mg/mL。使用2 U的α-半乳糖苷酶分别与1 mL这些底物在40 ℃条件下作用24 h。使用离子交换色谱仪测定半乳糖的释放量[19]。

1.4 统计分析

所有数据均为3个重复样品的平均值，采用SPSS13.0软件进行统计分析，判断彼此间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 作用时间对酶活力测定的影响

根据对硝基苯酚标准品的标准曲线获得回归方程：y=0.018 2x＋0.002 2（R2=0.999 8）。在酶反应的最初阶段，在反应开始后的2～10 min，反应速率最快，反应体系中对硝基苯酚的含量呈线性增加，继续反应，反应速率逐渐减缓，如图1所示。在酶化学反应过程中，酶反应的瞬时速率很难准确测定，并且反应后期反应速率下降，因此通常在酶反应的最初阶段测定初始反应速率。在本实验中，反应时间确定为10 min。

图1 酶反应的时间进程Fig.1 Time course of the α-galactosidase-catalyzed reaction

2.2 发酵过程中α-半乳糖苷酶酶活力变化曲线

菌株KLDS2.0509在pH6.0 TPY培养基中37 ℃条件下厌氧培养48 h，按照1.3.2节方法测定酶活力，以最高酶活力为100%，计算相对酶活力，其生长曲线和酶活力变化曲线如图2所示。菌株KLDS2.0509在培养4 h后进入指数生长期，在培养12 h后达到稳定生长期，α-半乳糖苷酶进入对数生长期后开始产生，进入稳定期后酶活力逐渐提高，在稳定期中期（24 h）酶活力到达最高值，继续培养酶活力呈现下降趋势，稳定期后期酶活力保持稳定。

图2 在培养48 h期间KLDS2.0509所产α-半乳糖苷酶活力和OD600nm的变化Fig.2 Relative activity of α-galactosidase produced by KLDS2.0509 and its optical density at 600 nm as a function of culture time

2.3 酶分离纯化

粗酶液先经(NH4)2SO4盐析，再通过透析除杂浓缩，最后浓缩液经Sephadex G-100凝胶柱层析，结果如图3所示。整个洗脱过程出现3个蛋白峰，通过测定各管酶活力，确定α-半乳糖苷酶主要集中在第1个蛋白峰内，说明经过Sephadex G100凝胶柱层析除去部分小于其分子质量的蛋白。

图3 Sephadex G-100凝胶柱层析洗脱曲线Fig.3 Elution curves of Sephadex G-100 column chromatography

粗酶液经过(NH4)2SO4盐析、透析、Sephadex-G100层析处理后，经12.5%的SDS-PAGE电泳检测，结果如图4所示，纯化后仅有一条蛋白条带，说明纯化效果较好。根据相对迁移率分子质量的关系，可以计算出其分子质量约为45kD。

图4 α-半乳糖苷酶SDS-PAGE电泳图谱EFig.4 SDS-PAGE of α-galactosidase at different separation and purification steps

α-半乳糖苷酶的纯化结果如表1所示，粗酶液的酶比活力1.69 U/mg，酶活力回收率为20.6%，纯化倍数为29.3，纯化酶的酶比活力为49.6 U/mg。实验结果与已报道的1株短双歧杆菌的α-半乳糖苷酶活相近，其粗酶液酶比活力为1.76 U/mg[20]，但是低于产α-半乳糖苷酶曲霉的粗酶液酶比活力(1.91 U/mg)[8]，也低于产α-半乳糖苷酶青霉的粗酶液酶比活力(9.6 U/mg)[19]，这与产α-半乳糖苷酶微生物的来源有关[21-22]。

表1 α-半乳糖苷酶的分离纯化Table 1 Purification of α-galactosidase from Bifidibacterium longum KLDS2.0509

2.4 α-半乳糖苷酶酶学性质

2.4.1α-半乳糖苷酶的最适pH值和pH值稳定性

如图5所示，该α-半乳糖苷酶的最适作用pH值为5.0，该酶在pH 4.5～6.0保持80%以上的相对酶活力。将该酶在不同pH值范围的缓冲液中37 ℃作用6 h后测其剩余酶活力，结果如图6所示，该酶在pH 5.0～6.0时最稳定，酶促反应6 h后酶活力仍保持在85%以上，随着pH值升高或者降低，稳定性均呈下降趋势。

图5 α-半乳糖苷酶最适作用pH值Fig.5 Optimum pH of the α-galactosidase

图6 α-半乳糖苷酶的pH值稳定性Fig.6 pH stability of the α-galactosidase

2.4.2α-半乳糖苷酶的最适温度和热稳定性

菌株LB21所产α-半乳糖苷酶的最适作用温度为42 ℃，如图7所示。随着酶促反应温度的升高，α-半乳糖苷酶酶活力逐渐增强，42 ℃达到最高值，温度继续升高，酶活力显著降低。

图7 α-半乳糖苷酶的最适作用温度Fig.7 Optimum temperature of the α-galactosidase

将该酶在不同的温度下作用2.5 h，然后测定剩余酶活力，结果如图8所示。该酶在40 ℃时，酶活力随着作用时间延长，呈现缓慢下降趋势，但是作用2.5 h后仍然保持65%的酶活力；当该酶在35 ℃时，作用2.5 h后，仍剩余82%的酶活力，表明该酶具有良好的热稳定性（P＜0.05）。该酶在50 ℃条件下随着时间的增加，酶活力迅速下降，1.5 h时完全丧失酶活性。因此该酶对50 ℃以上的高温较为敏感，但是在42 ℃以下进行酶促反应时，具有较高热稳定性。

图8 α-半乳糖苷酶的热稳定性Fig.8 Temperature stability of the α-galactosidase

2.4.3 不同金属离子对α-半乳糖苷酶的影响

金属离子对该α-半乳糖苷酶酶活力的影响如图9所示，大多数的金属离子对α-半乳糖苷酶的活性没有明显影响，Fe2+、Mn2+、Ag+和Cu2+对其酶活性有一定抑制作用，Cu2+对其酶活性的抑制最显著，相对酶活力为21.2%，而Hg2+完全抑制α-半乳糖苷酶的活性，表明该酶的活性中心部位可能存在含巯基的氨基酸（如半胱氨酸）。

图9 各种金属离子对α-半乳糖苷酶活力的影响Fig.9 Effects of various metal ions on α-galactosidase activity

2.4.4α-半乳糖苷酶的底物特异性分析

如表2所示，底物特异性测定表明该酶可以有效降解含α-半乳糖苷键的蜜二糖、棉子糖和水苏糖，但不能降解末端含α-半乳糖苷键的瓜尔豆胶，对3种底物的降解能力依次为蜜二糖＞水苏糖＞棉子糖。结果表明该酶具有降解豆制品中α-半乳糖苷类的寡糖的潜力，可用于消除或降低此类寡糖的抗营养作用，从而提高豆制品的利用率，增加豆制品的可食用人群。

表2 α-半乳糖苷酶水解蜜二糖、棉子糖、水苏糖后半乳糖的释放量Table 2 Release of galactose from melibiose, raffinose and stachyose hydrolyzedd bbyy α-galactosiiddaassee

3 结 论

长双歧杆菌KLDS2.0509α-半乳糖苷酶分子质量约为45 kD，纯化后的酶比活力为49.6 U/mg，最适作用pH值为5.0，酶活力随着pH值升高或者降低，均呈下降趋势；最适温度42 ℃，温度继续升高，酶活力显著下降。大多数的金属离子对酶的活性无显著影响，Fe2+、Mn2+、Ag+和Cu2+能够对其产生抑制作用，而Hg2+完全抑制酶活性；酶的底物特异性实验结果表明，该酶可降解蜜二糖、棉子糖和水苏糖，但不能降解末端含α-半乳糖苷键的多糖。该酶在40 ℃条件下保温2.5 h后仍然保持65%的酶活力，表明该酶具有良好的热稳定性。

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