利用HPLC法测定不同马铃薯品种茎叶中的α-茄碱含量

罗爱花，徐美蓉，陆立银，胡新元，文国宏，谢奎忠

（1.甘肃省农业科学院马铃薯研究所，甘肃兰州730070；2.甘肃省农业科学院质量标准研究所，甘肃兰州730070)

利用HPLC法测定不同马铃薯品种茎叶中的α-茄碱含量

罗爱花1*，徐美蓉2，陆立银1，胡新元1，文国宏1，谢奎忠1

（1.甘肃省农业科学院马铃薯研究所，甘肃兰州730070；2.甘肃省农业科学院质量标准研究所，甘肃兰州730070)

马铃薯茎叶具有较高的饲用价值，但马铃薯茎叶中α-茄碱（龙葵素）含量高，适口性差，不易青贮，是影响马铃薯茎叶利用的主要因素。研究马铃薯茎叶中龙葵素的含量变化可为其利用提供安全技术保障。将马铃薯茎叶收获后风干粉碎，用乙醇-乙酸法提取，高效液相色谱法(HPLC法)测定混合样品中的α-茄碱含量，研究不同马铃薯品种茎叶中α-茄碱含量的差异。结果表明：‘费乌瑞它’、‘克新2号’、‘陇薯3号’、‘陇薯6号’、‘陇薯7号’5个马铃薯品种茎叶样品中α-茄碱的含量分别为0.138，0.171，0.159，0.185和0.199 mg/g。茎叶中α-茄碱的含量存在基因型差异。

马铃薯；品种；茎叶；α-茄碱

α-茄碱（Solanine）称龙葵素，也叫马铃薯素，是从马铃薯、西红柿、茄子等茄科植物中发现的有毒的糖苷生物碱，具有抗肿瘤、抑菌、强心、镇痛等多种功效[1-3]。目前对马铃薯块茎中α-茄碱含量的提取以及测定已有很多不同的报道[4-6]，而对马铃薯茎叶、叶片中α-茄碱含量的研究报道相对较少。马铃薯茎叶柔嫩多汁，青贮马铃薯叶的营养成分明显高于许多青贮植物的茎叶，有较高的饲用价值[7,8]。但是马铃薯茎叶α-茄碱含量高，适口性差，含糖少，不易青贮，水分含量高，难以保存。α-茄碱是影响马铃薯茎叶利用的主要因素，通过研究马铃薯茎叶中α-茄碱的含量变化可为其利用提供安全技术保障。马铃薯植株中糖苷生物碱的含量根据品种及起源、生育时期、器官、栽培和贮藏条件等不同而有比较大的差异[9]。了解马铃薯整个植株中α-茄碱含量的高低，对马铃薯茎叶利用乃至生物碱开发有着极其重要的意义。

本试验通过系统优化筛选HPLC分析条件，建立了快速、准确分析马铃薯中α-茄碱的HPLC方法，为马铃薯中α-茄碱提取物的工业化生产和开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

1.1.1 材料

以马铃薯品种‘费乌瑞它’、‘克新2号’、‘陇薯3号’、‘陇薯6号’、‘陇薯7号’的茎叶风干粉碎混合样为试验材料。

1.1.2 仪器

Waters 2595高效液相色谱仪（美国Waters），2487紫外检测器（美国Waters）。

1.1.3 试剂

α-茄碱（标样，Sigma公司，纯度≥99%），乙醇（AR 95%），冰醋酸（AR），甲醛（AR），乙腈（CP），氨水（AR），硫酸（AR），甲醇（CP），磷酸（AR）。

1.2 色谱条件

色谱柱：C18不锈钢柱（ODS 5 μm,4.6 mm× 25 cm）；流动相：乙腈/磷酸二氢钾(30∶70，V/V);流速：1.0 mL/min；检测波长：210 nm；柱温：30℃；进样量：20 μL。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备

将马铃薯茎秆和叶片经风干、粉碎混匀待用。称取粉碎后马铃薯茎叶混合样12 g，加无水乙醇/乙酸混合提取液（100∶30，V/V）搅拌10 min，70℃回流10 h后过滤，滤液旋转蒸发至浸膏状，用5%硫酸20 mL溶解膏状物，超声处理45 min后过滤，滤液用浓氨水调至pH=10，低温离心（5 000 r/min） 15 min，弃去上清液，沉淀用l%氨水洗涤，至洗涤液澄清，将结晶状沉淀用甲醇溶解并定容至10 mL，过0.45 μm膜过滤备用。

1.3.2 α-茄碱含量测定

α-茄碱标准曲线测定：准确称取α-茄碱标准品30 mg，以甲醇溶解，分别配制成0.15、0.30、0.60、1.20、1.80、2.40和3.00 mg/mL的标准液，在上述色谱条件下进样10 μL，以α-茄碱的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

马铃薯茎叶中α-茄碱含量定性分析：在最优色谱条件下对马铃薯茎叶中α-茄碱成分进行分离。采用保留时间对照法和内标法确定α-茄碱的出峰时间。准确称取马铃薯茎叶混合样品12 g，分别加入一定量的α-茄碱标准品，以峰面积外标法定量测定混合样中α-茄碱的含量，5次重复，计算平均回收率和相对标准偏差（RSD）。

马铃薯茎叶中α-茄碱定量的测定：取各提取样品溶液10 μL进样，在最优色谱条件下进行HPLC分析，测定α-茄碱含量。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

在190～400 nm波段对α-茄碱标准溶液进行紫外扫描，确定最大吸收峰波长为208 nm。当检测波长为208 nm，柱温为30℃，流速为1.0 mL/min，流动相为乙腈/磷酸二氢钾(30∶70，V/V)时，马铃薯茎叶中α-茄碱与其他峰都可得到分离。

2.2 标准曲线的拟合度

以确立的最优色谱条件进行测定标准曲线值，以α-茄碱的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线得回归方程：Y=7.21×105X+3.4×103，相关系数r=0.999。重复进样5次，计算相对标准偏差(RSD)=0.57%（＜1%），表明方法重现性良好。

2.3 标准品与马铃薯茎叶样品中α-茄碱的定性分析

用HPLC测定标样的α-茄碱，出峰时间和分离效果如图1所示。从图1可以看出，α-茄碱在确立的最优色谱条件下的保留时间约4.755 min，分离较好。在确立的最优色谱条件下进行HPLC分析，样品及外标中的α-茄碱峰保留时间与α-茄碱标样的基本重合，分别为4.765和4.772 min，并与其他组份达到了较好的基线分离。

图1 α-茄碱标准品和样品色谱图Figure 1HPLC chromatogram of α-solanine standard and sample

表1 不同马铃薯品种茎叶中α-茄碱含量Table 1α-Solanine content in stem and leaf mixed samples of different potato varieties

2.4 马铃薯茎叶中α-茄碱的HPLC法测定

将1.3.1中制备好的5种样液在确立的最优色谱条件下测定，根据外标法计算其中的α-茄碱含量，结果见表1。

通过乙醇/乙酸混合提取，HPLC法测定5个马铃薯品种茎叶混合风干样品中的α-茄碱含量，结果表明，5个品种中，晚熟品种‘陇薯7号’茎叶混合样中的α-茄碱含量最高，早熟品种‘费乌瑞它’茎叶混合样品中的α-茄碱含量最低。统计分析表明，参试品种间茎叶混合样品的α-茄碱含量存在基因型差异，且差异水平达到极显著水平。

2.5 回收率与精密度

称取已测定了α-茄碱含量的正常马铃薯茎叶提取样品，分别加入一定质量的α-茄碱标准品，按样品测定方法进行测定，见表2。结果显示，该试验回收率较高，总平均回收率为94.3%，因此检测结果可靠。

将同一样品取样3次，进样测定α-茄碱含量，做精密度实验,测定结果见表3。5个马铃薯品种茎叶α-茄碱含量多次测定结果RSD＜1%，表明该方法精密度良好，测定值准确可靠。

表2 马铃薯茎叶中α-茄碱的回收率Table 2Collection ratio of α-solanine content in potato stem and leaf

表3 试验结果的精密度(mg/g)Table 3Degree of precision for experimental results

3 讨论

有研究表明，马铃薯茎叶具有较好的饲用价值，1 kg茎叶含有0.12个饲料单位，20～40 g可消化蛋白质，80 mg胡萝卜素，干物质含量为18.4%，粗蛋白质占干物质的16.2%，粗纤维占干物质的20.8%，粗脂肪占干物质的1.8%，钙含量为1.39%，磷含量为0.14%[6,8]。随着马铃薯产业的不断发展，会产生越来越多的马铃薯茎叶废弃物而得不到有效利用，浪费了资源。然而马铃薯茎叶中含有有毒的α-茄碱，导致了茎叶适口性差，加上茎叶中含糖量少，水分含量高，难于保存利用，而且不同马铃薯品种及其起源、生育时期、器官、栽培和贮藏条件等均对植株中糖苷生物碱的含量存在很大影响。

不同品种（系）马铃薯龙葵素含量不同，这和本试验证明马铃薯茎叶中龙葵素含量存在基因型差异的结果一致。同一品种的马铃薯若遭受机械损伤、变绿、虫蛀、长芽和局部霉变等均会导致龙葵素含量的增加，研究表明，受伤可使块茎龙葵素含量高出正常块茎16倍之多[10]。韩俊清[8]研究表明，马铃薯茎叶经干制后营养损失大，霉菌滋生，适口性更差。α-茄碱具有一定的光、热稳定性，光照会导致龙葵素增多，因而研究马铃薯茎叶中α-茄碱的含量变化可为其安全利用提供理论和技术支持。有研究表明对收获后的马铃薯茎叶预干处理之后进行生物添加剂，如乳酸菌制剂、酶制剂等处理可以改善马铃薯茎叶青贮饲料品质[11-14]，这对了解马铃薯茎叶中α-茄碱的含量变化和合理利用丰富的马铃薯资源提供了技术支撑。

本课题组成员目前正在开展对不同马铃薯品种茎叶进行生物制剂添加处理来研究对茎叶青贮饲料品质的影响研究，初步发现对茎叶进行预干处理后添加乳酸菌和酶制剂后青贮饲料品质较优，对其中α-茄碱含量的变化影响如何有待进一步研究。

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HPLC Method for Determination of α-Solanine Content in Stem
and Leaf of Different Potato Varieties

LUO Aihua1＊,XU Meirong2,LU Liyin1,HU Xinyuan1,WEN Guohong1,XIE Kuizhong1
(1.Institute of Potato,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou,Gansu 730070,China;2.Institute of Agricultural Quality
Standards and Testing Technology,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou,Gansu 730070,China)

Stemandleafofpotatohavehighfeedingvalues,buthighcontentofα-solanineinpotatostemandleaf,which leads to poor palatability and difficulty in silage storage,is the main factor affecting utilization for potato stem and leaf. Understanding the content changes in α-solanine of stem and leaf could provide technical support for their safe use.After harvesting,stem and leaf of potato were dried and crushed,the mixed samples were extracted with ethanol acetic for α-solanine,and then high performance liquid chromatography(HPLC method)was used to determine its changes in different potatovarieties.Theresultsshowedthat theα-solaninecontentsofstemandleafin'Favorita','Kexin2','Longshu3','Longshu 6',and'Longshu7'were0.138,0.171,0.159,0.185and0.199mg/g,respectively.Theα-solaninecontentofstemsandleaves hasgenotypicdifference.

potato;variety;stem and leaf;α-solanine

S532

B

1672－3635（2014）06-0331-04

2014-09-19

甘肃省农业科学院2012年青年基金（2012GAAS15-11）；甘肃省农业科学院2012年科技创新项目（2012GAAS08）。

罗爱花（1977-），女，副研究员，主要从事马铃薯栽培及抗逆生理研究。

罗爱花，E-mail:florancehua@163.com。