利用晚疫病菌无毒基因瞬时表达技术鉴定马铃薯抗病基因

周晶，张子莹，路远，田振东，谢从华

（园艺植物生物学教育部重点实验室，国家蔬菜改良中心华中分中心，华中农业大学，湖北武汉430070)

病虫防治

利用晚疫病菌无毒基因瞬时表达技术鉴定马铃薯抗病基因

周晶，张子莹，路远，田振东*，谢从华

（园艺植物生物学教育部重点实验室，国家蔬菜改良中心华中分中心，华中农业大学，湖北武汉430070)

由Phytophthora infestans引起的晚疫病是马铃薯的毁灭性病害。明确现有马铃薯品种或育种材料含有的晚疫病抗病基因，对于抗病育种和合理利用不同抗病基因防治马铃薯晚疫病具有重要意义。根据“基因对基因”学说，马铃薯无毒基因与抗病基因产物互作会产生典型过敏反应（HR）。理论上利用病原菌无毒基因可以鉴定马铃薯是否含有相应抗病基因。本研究尝试利用农杆菌注射技术，在马铃薯叶片中瞬时表达晚疫病菌无毒基因（Avr），根据过敏反应发生情况，进而推断马铃薯品种/育种材料所含相应抗病基因（R）。研究结果显示：适合马铃薯瞬时表达的农杆菌浓度为0.5（OD600），马铃薯材料农杆菌瞬时表达存在明显的基因型和叶龄依赖性，充分展开的幼嫩叶片适合农杆菌瞬时表达。Avr1,Avr2,Avr3a和Avr4在含有相应抗病基因的马铃薯鉴别寄主上瞬时表达能够产生HR，表明无毒基因注射鉴定结果是可靠的。无毒基因注射鉴定结果与抗病基因特异引物PCR扩增结果在不同基因型材料上有时并不一致，反映了这两种方法各有局限性，若能将这两种方法结合使用，则会提高鉴定结果的准确性。

马铃薯；晚疫病；无毒基因；抗病基因；瞬时表达；农杆菌注射

马铃薯是世界第四大粮食作物，仅次于水稻、玉米和小麦[1]。马铃薯在生产过程中受到多种病原菌的危害，其中由致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的晚疫病是最严重的病害之一。选育抗晚疫病品种是防治晚疫病最经济、最环保的方法。当前马铃薯抗晚疫病育种利用的抗病基因主要是来自野生种Solanum demissum的R1-R11 11个主效R基因[2]。这11个主效R基因已被定位，其中R1、R3a和R3b基因已被克隆[3-5]；R1、R2、R3、R4和R10基因已经被广泛的用于马铃薯育种[6]。另外来自于不同马铃薯野生种的10多个不同R基因也已被克隆[6,7]，这些抗病基因的克隆为马铃薯抗晚疫病育种提供了重要基因资源。由于晚疫病病菌变异迅速，导致马铃薯抗病基因很快失去抗性[8]。因此，在不同产区根据晚疫病生理小种组成来选择合适的抗病品种就显得尤为重要。目前国内研究者已开展了马铃薯产区晚疫病菌生理小种变化的动态监测，基本明确了病原菌群体结构，为晚疫病防治奠定了基础[9-11]。中国已育成马铃薯品种近300个，但是这些品种含有那些抗病基因并不清楚，这对合理布局含有不同抗性基因的品种防治晚疫病造成很大困难。

根据“基因对基因”假说[12]，抗病基因产物和病原菌无毒基因（Avr）产物识别可以产生过敏反应（Hypersensitive response,HR），因此，理论上可以利用病原菌无毒基因鉴别寄主所含相应抗病基因。目前已在晚疫病菌中鉴定了数个无毒基因（Avr1-R1、Avr2-R2、Avr3a-R3a、Avr3b-R3b和Avr4-R4等），这些无毒基因产物与其对应抗病基因产物识别可以产生典型HR反应[13]。本氏烟草农杆菌注射瞬时表达技术（Agro-infiltration）已成功用于马铃薯抗性（R）基因与病原物无毒（Avr）基因间的相互作用研究[14]。但在马铃薯上进行农杆菌注射瞬时表达还存在一定困难，主要表现在基因型依赖性，有些材料不适合注射，有些材料注射后没有反应。作为一种探索性工作，本研究利用Agro-infiltration技术将几个已知晚疫病菌无毒基因在不同马铃薯材料叶片中进行瞬时表达，根据HR反应发生情况，期望快速、准确鉴定马铃薯栽培品种及育种材料所含抗病基因，为利用抗病品种合理布局防治晚疫病和抗病育种奠定技术基础。

1 材料与方法

1.1 马铃薯材料

马铃薯鉴别寄主材料LBR-R1,2,3,4和10种薯由华中农业大学实验室保存，经过催芽在塑料大棚内种植。栽培品种‘华恩1号’、‘青薯168’、‘会-2’、‘郑薯5号’和‘鄂马铃薯3号’及育种材料‘93008’、‘93011’和‘93014’叶片采自马铃薯实验室温室种植材料。

1.2 无毒基因瞬时表达载体

含有Avr1，Avr2，Avr3a，Avr4和Avr10晚疫病菌无毒基因的双元表达载体由华中农业大学马铃薯实验室提供，无毒基因插入双元表达载体pCB-302-3中。含有p19质粒的表达载体用于防止外源基因沉默。pCB-302-3空载体为阴性对照，含有Avr3a/R3a或Vnt1/AvrVnt1基因对的载体为阳性对照。所有质粒都转化到农杆菌菌株GV3101中。

1.3 农杆菌活化、扩大培养和注射用农杆菌菌液准备

（1）活化：将含有相应无毒基因载体的保存菌液在含有Rif和Kan（50 mg/L）LB固体培养基（胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂15 g/L）平板上划线活化，36～48 h后挑选单菌落，在含有相应抗生素的1 mL LB液体培基中于28℃，250 r/min培养24 h。

（2）扩大培养：取10 μL上述培养菌液，加入含有相应抗生素的5 mL YEB液体培基（胰蛋白胨5 g/L，酵母提取物1 g/L，牛肉浸膏5 g/L，MgSO4·7H2O，0.5 g/L）的离心管中，于28℃，250 r/min条件下培养24 h。

（3）注射菌液准备：将扩大培养的菌液4 000 r/min离心10 min收集菌体，后加入等体积MMA（10 mmol/L MES(2-N-吗啡啉乙磺酸)，10 mmol/L MgCl2，200 mmol/L AS（乙酰丁香酮），pH 5.7）悬浮液，悬浮后离心，4 000 r/min离心10 min；倒掉多余MMA，加入1/2体积的MMA，再次悬浮；检测600 nm下的OD值，用MMA稀释到试验所需OD600值；加入含p19载体的农杆菌，室温静置2 h左右用于注射。

1.4 马铃薯叶片注射

选择较幼嫩（出苗后40 d）健康的马铃薯复叶，事先在叶片上标注注射位点，用2 mL的一次性注射器吸取菌液，在划定位置上按压注射，注意不要损伤叶片，以免影响HR反应的辨别；每个处理至少做3次重复，复叶叶柄插入装有无菌水的三角瓶中，然后将三角瓶放入大塑料框中，用塑料膜覆盖置于（22±2）℃的房间，12 h光照。每天叶面喷水雾一次，3 d后观察叶片HR发生情况，记录并拍照。

1.5 马铃薯基因组DNA提取与PCR扩增

马铃薯材料基因组DNA小量抽提采用CTAB法。

用于R基因PCR特异扩增的引物根据已有报道设计，具体见表1。PCR体系（20 μL）：ddH2O 15.9 μL，dNTP(10 μmol/L)0.3 μL，10×Buffer 2 μL，Primer F (10 μmol/L)0.3 μL，Primer R(10 μmol/L)0.3 μL，Taq酶0.2 μL，DNA模板1 μL。扩增程序：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，50～60℃退火30 s，72℃延伸1～2 min，35个循环后72℃延伸10 min。退火温度和延伸时间根据具体引物确定。

表1 R基因特异引物序列Table 1R gene specific PCR primers

2 结果与分析

2.1 瞬时表达体系的优化

农杆菌浓度是影响瞬时表达效果的关键因素。本试验首先在马铃薯鉴别寄主‘LBR-R3’叶片上分别注射不同OD600值（0.5，1.0和1.5）的含有Avr3a载体、阴性和阳性对照载体的农杆菌（添加含有p19载体农杆菌），观察注射后马铃薯叶片的HR反应。结果显示在注射8 d后，3个浓度阳性对照和Avr3a注射点都出现明显HR反应，但是当OD600值为1.5时，个别阴性对照也会出现比较弱的HR反应，而OD600值为0.5，1.0时阴性对照病均未出现HR反应。表明OD600值为0.5菌液浓度适合在马铃薯上瞬时表达，浓度高时可能引起假象。图1显示鉴别寄主‘LBR-R3’叶片用OD6000.5农杆菌液注射不同天数后HR反应发生情况。

2.2 5个病原菌Avr基因在含有相应R基因鉴别寄主上的表型

为了鉴别Avr1，Avr2，Avr3a，Avr4和Avr10 5个病原无毒基因在含有相应抗病基因的鉴别寄主上能否诱发HR反应，本研究分别在5个鉴别寄主上用OD6000.5的农杆菌液进行叶片注射。结果显示注射后3～7 d,Avr1，Avr2，Avr3a和Avr4在相应鉴别寄主上能够诱发HR反应，但Avr10没有诱发HR反应（图2）。

图1 OD6000.5农杆菌菌液(含有Avr3a)注射鉴别寄主‘LBR-R3’叶片不同天数后HR表型Figure 1HR development on potato‘LBR-R3’leaves after agro-infiltrating with 0.5 OD600Agrobacterium suspensions(containing Avr3a)

图2 无毒基因Avr1、Avr2、Avr3a、Avr4和Avr10在相应鉴别寄主上诱发的HR反应Figure 2HR trigged by transient expressing Avr1,Avr2,Avr3a,Avr4 and Avr10 on R gene diagnose potato materials

表2 马铃薯鉴别寄主上的HR发生频率Table 2HR frequency appeared on corresponding‘LBR-R’plant leaves

进一步统计了无毒基因在相应鉴别寄主上HR的发生频率（表2），结果显示阳性对照在所有马铃薯材料上均出现HR，阴性对照均未出现HR。从表2可以看出，Avr1,Avr2,Avr3a和Avr4均在对应的‘LBR-R’上产生HR；Avr10未出现HR。Avr2，Avr3a重复性最好，为100%，Avr1次之，Avr4重复性最差。结果表明在有足量重复的前提下，利用这些病原无毒基因、采用农杆菌注射法检测寄主含有相应抗性基因是可靠的。

2.3 马铃薯栽培品种及育种材料叶片无毒基因农杆菌注射结果

为了检测这5个晚疫病菌无毒基因能否在栽培品种和育种材料上激发HR反应，从而判断这些品种可能含有的抗病基因，选取栽培品种‘华恩1号’、‘早大白’、‘会-2’、‘中薯3号’和‘鄂马铃薯3号’、‘郑薯5号’及育种材料‘93008’、‘93011’和‘93014’叶片进行了3次重复农杆菌注射试验。结果表现出三种类型（图3）：A.阳性对照出现HR,空白未出现HR，表明这些马铃薯材料（‘鄂马铃薯3号’，‘93008’、‘93011’和‘93014’）适合农杆菌注射（图3A）。B.所有叶片注射点均产生明显的坏死斑，表明这些材料（‘华恩1号’、‘早大白’和‘会-2’）对农杆菌侵染表现很敏感（图3B），不适合采用农杆菌瞬时表达技术来鉴定其所含晚疫病抗性基因。C.注射点均未产生明显的HR(图3C)，表明此类马铃薯材料（‘中薯3号’、‘郑薯5号’）对农杆菌侵染表现很不敏感，这类材料也不适合采用农杆菌瞬时表达技术来鉴定其所含晚疫病抗性基因。

‘鄂马铃薯3号’经相应无毒基因鉴定可能含有抗病基因R1、R2、R3、R4和R10，育种材料‘93008’可能含有抗病基因R2、R3和R4，育种材料‘93011’和‘93014’可能含有抗病基因R2和R3（图3A）。

图3 不同马铃薯品种(材料)叶片注射无毒基因后的表型Figure 3Phenotype on different potato leaves after infiltration with different Avr genes

2.4 R基因特异性引物PCR检测

为了检验无毒基因农杆菌瞬时表达鉴定结果是否与分子检测一致，本研究根据文献报道的5对晚疫病抗病基因特异引物序列合成PCR扩增引物（表1）。以抽提的马铃薯基因组DNA为模板进行PCR扩增。结果显示R2、R2 family和R4 3对基因特异引物无PCR扩增产物。R1、Rpi-abpt和R3a基因特异引物可以扩增出预期大小的带型。马铃薯材料‘93011’、‘93014’和品种‘早大白’能够扩增出R1片段（1 400 bp）的条带（图4A），‘鄂马铃薯3号’和‘93011’能够扩增出Rpi-abpt（686 bp）片段（图4B）；马铃薯材料‘93011’和品种‘早大白’能够扩增出R3a片段（980 bp）（图4C）。尽管本研究使用文献报道的R基因特异引物进行扩增，并且扩增出与目标片段大小一致的产物，但由于没有对产物进行测序，因此，不能准确判断扩增出的片段就是对应R基因的片段，也有可能是其等位基因产物。

图4 R1、R2、R3a和R4基因在马铃薯材料中的PCR鉴定Figure 4PCR amplification in different potato materials using R gene specific primers

表3 农杆菌注射结果与基因特异引物PCR结果比较Table 3Comparison of agro-infiltration andRgene specific primers PCR amplification results

2.5 两种方法的一致性比较

为了比较农杆菌注射与R基因特异引物PCR结果之间的异同，将两种方法的结果进行了归类（表3）。由表3可看出，对于鉴别寄主‘LBR-R1’和‘LBR-R3’，病原无毒基因Avr1和Avr3a农杆菌注射结果与PCR结果一致。Avr2和Avr4尽管农杆菌注射结果为阳性，但PCR没有扩增出目标带。对于马铃薯品种和育种材料，Avr2和Avr3a农杆菌注射在4个材料（‘鄂马铃薯3号’、‘93008’、‘93011’和‘93014’）中出现阳性的频率较高，但是无相应PCR扩增产物。材料‘93011’、‘93014’和‘早大白’PCR扩增出R1目标带，但是Avr1注射为阴性。由此可见，两种方法鉴定结果存在不一致性。

3 讨论

明确现有马铃薯品种含有的晚疫病抗病基因，对于合理利用品种抗性防治马铃薯晚疫病具有重要意义。马铃薯晚疫病抗性基因的鉴定一般采用接种含有已知无毒基因的晚疫病菌小种，通过抗性反应来推断其是否含有相应抗性基因，这种方法费工费时。目前，中国绝大多数栽培品种所含晚疫病抗病基因种类不清楚，本研究利用晚疫病菌无毒基因农杆菌瞬时表达技术探索鉴别马铃薯品种含有的抗病基因的方法，以期为利用该方法鉴定马铃薯栽培品种及育种资源晚疫病抗性基因奠定基础。

从研究结果（表2）来看，Avr1、Avr2、Avr3a和Avr4均能够在对应的鉴别寄主上产生HR，表明这4个无毒基因注射结果是可靠的。但是，不同无毒基因注射点出现HR的频率有一定差异。如果注射点有足够数量，利用该方法鉴定马铃薯材料所含抗病基因还是可靠的。农杆菌瞬时表达时菌液浓度是一个重要参数，从本研究结果来看，0.5 OD600是比较理想的浓度。农杆菌本身作为一种植物病原菌，很容易引起马铃薯系统抗性，因此，浓度太高时可能导致注射点出现坏死斑，造成假象。由于不同马铃薯材料的叶片厚薄和致密程度差别很大，有些马铃薯材料很难注射；本研究结果显示叶片生理状态也是一个显著影响农杆菌注射效果的关键因素，不同叶龄的叶片敏感性不同，充分展开的幼嫩叶片容易注射，HR出现的时间也比较快，老叶很不敏感，不适宜农杆菌瞬时表达。另外发现有些马铃薯材料即使幼叶也不能产生HR反应。可见农杆菌瞬时表达在马铃薯材料上存在明显的基因型和叶龄依赖性。

理论上马铃薯现有品种抗性基因的鉴定也可利用已知抗病基因特异引物和分子标记进行PCR鉴定，但是到目前为止，能够用于进行抗病基因分子诊断的实用基因特异引物和分子标记并不多[17]。本研究利用文献报道的基因特异引物进行了PCR扩增，结果显示在鉴别寄主上只有Avr1和Avr3a农杆菌注射结果与PCR结果一致。其余无毒基因农杆菌注射结果与PCR结果并不一致，有的无毒基因农杆菌注射结果为阳性，PCR结果为阴性，有的无毒基因农杆菌注射结果为阴性，PCR结果为阳性。反映了这两种方法的局限性和复杂性。PCR结果也有不确定的因素，一则抗病基因往往与无功能的假基因或同源体成族出现，即便是基因特异引物也有可能出现假阳性扩增，例如有可能扩增出R基因的等位基因；二则即便是同一抗病基因，在不同马铃薯材料中可能存在碱基序列变化，如果碱基序列变异位置位于引物结合区域，也可能导致不能扩增。另外，马铃薯材料中也有可能存在多个识别同一无毒基因产物的蛋白。综上所述，无毒基因农杆菌注射和基因特异引物PCR扩增鉴定马铃薯材料所含抗病基因都存在不足之处。若将Avr基因农杆菌瞬时表达和抗病基因特异引物PCR扩增结合起来，则会提高鉴定的准确性。如果两种方法一致，鉴定的准确性会更可靠；即使不一致，至少两种方法能够提供互补的有价值信息，可以帮助我们判断马铃薯材料可能含有那些抗病基因。

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《中国马铃薯》杂志编辑部

2014年8月25日

Identification of Late Blight Resistance R Genes of Potato by Transient Expressing of Phytophthora infestans Avirulence Genes
Using Agro-infiltration

ZHOU Jing,ZHANG Ziying,LU Yuan,TIAN Zhendong＊,XIE Conghua
(Key Laboratory of Horticultural Plant Biology(HAU),Ministry of Education;National Center for Vegetable Improvement(Central China);
Huazhong Agricultural University,Wuhan,Hubei 430070,China)

Late blight,caused by Phytophthora infestans,is a devastating disease of potato.It is important to distinguish what kind of R contained in potato cultivar or potato breeding materials for potato late blight resistant breeding and control late blight through management of different R genes.According to the‘gene-for-gene’hypothesis,the interaction between pathogenavirulencegenes（Avr）andresistantgenes（R）willleadtohypersensitiveresponse（HR）inpotato.So,itispossible to distinguish host R gene by Avr gene expression in potato leaves.In this study,efforts were made to distinguish potato R genes by transient expressing P.infestansAvr gene in potato leaves using agro-infiltration methods.The result revealed that 0.5 optical density at 600(OD600)was suitable for potato agro-infiltration.Agro-infiltration mediatedAvr expression efficiency depended on potato genotype and leaf age.Full expanded younger leaves were fit forAgro-infiltration mediated transientAvr gene expression.Transient expressing Avr1,Avr2,Avr3a and Avr4 in leaves of diagnose potato material which containscorresponding R genes led to HR.Identification results of both agro-infiltration method and R gene specific primers PCR amplification were not consistent in some potato genotypes,reflecting that both methods have some defects.The desirable resultscouldbeobtainedbycombiningthetwomethods.

potato;late blight;avirulence gene;resistant gene;transient expression;agro-infiltration

S532

A

1672－3635（2014）04-0217-08

2014-07-02

国家“863”项目（2013AA102603）；国家自然科学基金项目（31171603）；华中农业大学2013年大学生科技创新基金（SRF 2013222）。

周晶（1991-），女，硕士研究生，研究方向为马铃薯抗病分子生物学。

田振东，教授，从事马铃薯分子生物学研究，E-mail:tianzhd@mail.hzau.edu.cn。