秀丽隐杆线虫胆固醇7，8-脱氢酶在大肠杆菌中的表达

格日勒，申雁冰，任佳佳，汤 睿，王 敏

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

秀丽隐杆线虫胆固醇7，8-脱氢酶在大肠杆菌中的表达

格日勒，申雁冰，任佳佳，汤 睿，王 敏

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

胆固醇7，8–脱氢酶是参与胆固醇代谢的还原酶，可以将胆固醇转化为7–脱氢胆固醇(合成维生素D3的重要中间体)．合成秀丽隐杆线虫的胆固醇7，8-脱氢酶基因daf-36，与具有T7强启动子的载体pET32a(+)连接后，成功构建pET32a-daf-36表达质粒，转入大肠杆菌表达系统E. coli BL21(DE3)和E. coli Rosetta(DE3)，经过IPTG诱导培养，蛋白质电泳图谱及质谱结果表明此酶得到了高效表达．

胆固醇7，8–脱氢酶基因daf-36；基因克隆；大肠杆菌；蛋白质表达

胆固醇7，8–脱氢酶(cholesterol 7，8-dehydrogenase)是参与胆固醇代谢的一种氧化还原酶，可以将胆固醇转化为7–脱氢胆固醇．7–脱氢胆固醇是合成维生素D3的重要中间体．随着世界人口的不断增加和各国国民经济的发展以及人们生活水平的提高，市场对维生素D3的需求量不断上升[1]．目前维生素D3的生产难点在于其前体物7–脱氢胆固醇的合成[2].中国科学院原感光化学研究所于20世纪90年代初提出一条7–脱氢胆固醇的化学合成路线，并取得了较好的实验结果[3]；但该合成路线中化学反应步骤多，涉及许多有机试剂的使用，条件不易控制，且副产物多，转化效率低，环境污染严重．寻求能够替代化学法的维生素D3生物合成技术是目前研究的热点[4]．有研究[5]发现，一些动物的组织和器官在体内和体外合适条件下可将胆固醇直接转化为7–脱氢胆固醇．经研究发现在家蚕前胸腺中表达并命名的neverland基因(nvd-Bm)与胆固醇7，8–脱氢酶相关，并且在果蝇中证实存在有功能类似neverland基因(nvd-Dm)[6]．Niwa等[7]研究表明，该基因对合成蜕皮激素的中间产物7–脱氢胆固醇至关重要，Rottiers等[8]发现，秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)在合成dafachronic acid过程中，也有此功能类似的daf-36基因．本文尝试利用基因工程技术实现胆固醇7，8-脱氢酶daf-36在大肠杆菌中的高效表达．

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与质粒

菌种E. coli DH5α、E. coli BL21(DE3)和E.,coli Rosetta(DE3)及质粒pET32a(+)由天津科技大学微生物制药研究室保存．实验中使用pET系列载体通用引物T7和T7ter由华大基因公司合成．

1.1.2 主要试剂和仪器

Taq DNA聚合酶、限制性内切酶Hind Ⅲ和EcoRⅠ、T4连接酶、DNA marker、蛋白marker，大连宝生物技术有限公司；提取质粒试剂盒，北京庄盟国际生物基因科技有限公司；凝胶回收试剂盒，北京天恩泽基因科技有限公司．

PCR仪，Thermo公司；凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司；紫外可见分光光度计，岛津仪器(苏州)有限公司；超声细胞破碎仪，宁波新芝生物技术股份有限公司．

1.2 目的基因daf-36的获取

从NCBI数据库中获得秀丽隐杆线虫的基因daf-36序列登录号：NM_073,228.4．首先进行大肠杆菌偏爱型密码子的优化，提交金唯智基因公司合成，然后连接在载体pUC57上，构建pUC57-daf-36重组质粒．

1.3 表达载体pET32a-daf-36的构建

将pUC57-daf-36重组质粒经内切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切后，胶回收的daf-36与同样处理过的pET32a(+)在T4连接酶的作用下进行连接，按照载体与插入片段物质的量比为1∶3的比例配制连接体系，16,℃连接12,h，获得表达载体pET32a-daf-36，然后采用化学转化法转入E. coli DH5α 感受态中．挑取单克隆于含有100,µg/mL氨苄抗生素的5,mL LB培养液中，37,℃过夜培养．取菌液，使用pET系列载体通用引物T7和T7ter进行PCR验证，小量提取质粒，限制性内切酶Hind Ⅲ和EcoRⅠ酶切验证正确后，送往华大基因公司测序．

1.4 工程菌株的构建

选取测序验证正确的重组质粒，采用化学转化法转入表达宿主E. coli BL21(DE3)和E. coli Rosetta (DE3)，挑取单克隆于含有100,µg/mL氨苄抗生素的5,mL LB培养液中，37,℃过夜培养．取菌液进行PCR验证，获得大肠杆菌工程菌株，命名为E.,coli BL21 (DE3)-daf-36和E.,coli Rosetta(DE3)-daf-36．

1.5 工程菌的表达

将大肠杆菌工程菌株E.,coli BL21(DE3)-daf-36和E.,coli Rosetta(DE3)-daf-36过夜培养，以1%接种量接入含有100,µg/mL氨苄抗生素的50,mL LB培养液中，37,℃、180,r/min培养至600,nm吸光度约0.6；加入终浓度为1,mmol/L的IPTG溶液，相同条件下继续培养5,h，收集菌体；将其超声破碎，分别取破碎后上清液、沉淀样品，用SDS-PAGE检测确定蛋白的表达形式．

1.6 蛋白质谱分析

取1,mL经诱导培养的工程菌株培养液，离心收集菌体，SDS-PAGE(分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%)检测蛋白的表达情况，电泳结束后，室温条件下，用考马斯亮蓝R250染色2,h，过夜脱色．选取与目的蛋白相对分子质量(含Trx融合标签)相符合的蛋白条带，用手术刀将胶切成1,mm3左右胶块，置于1.5,mL Eppendorf管中，用200,µL双蒸水洗2次，每次10,min，经胰蛋白酶(Trypsin)酶解后用Thermo LTQ XL蛋白质谱仪分析，离子源为NSI，毛细管电压3.5,kV，离子源温度260,℃，脱溶剂气温度260,℃，检测器电压200,V．HPLC流动相A液为体积分数0.1%的FA水溶液(水为质谱级)，B液为体积分数0.1%的FA乙腈溶液(乙腈为质谱级)；流量200,µL/min，梯度洗脱120,min．

2 结果与分析

2.1 表达载体的构建

从已构建好的pUC57-daf-36重组质粒中用限制性内切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ切下daf-36片段，插入pET32a(+)载体，质粒构建见图1．

挑取单克隆接种至含有100,µg/mL氨苄抗生素的5,mL LB培养液中，37,℃、180 r/min过夜培养后，保存甘油菌，并取适量菌液，使用通用引物进行PCR鉴定．菌液PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测(图2(a))，目的条带在2,100,bp左右，与预期相符，小量提取该菌株的质粒，使用限制性内切酶进行双酶切鉴定．双酶切后的表达载体pET32a-daf-36电泳结果(图2(b))显示5,900,bp为载体条带，1,287,bp为目标条带，其条带数量和大小均符合要求．测序结果表明目的片段的序列符合度为100%，表明成功构建得到表达载体pET32a-daf-36．

2.2 工程菌株的构建

挑取单克隆于含有100,µg/mL氨苄抗生素的5,mL LB培养液中，37,℃过夜培养．取菌液用通用引物T7和T7ter进行PCR验证，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测(图3)，目的条带在2,100,bp左右，与预期相符．这表明工程菌株E.,coli BL21(DE3)-daf-36和E.,coli Rosetta(DE3)-daf-36构建成功．

2.3 工程菌E.,coli BL21(DE3)-daf-36和E.,coli Rosetta(DE3)-daf-36的蛋白表达

根据NCBI报道[9]，目的蛋白含有428个氨基酸，相对分子质量约为4.955×104，载体的融合标签相对分子质量约为1.6×104．

工程菌E. coli BL21(DE3)-daf-36采用1,mmol/L的IPTG溶液37,℃诱导5,h，SDS-PAGE电泳检测，结果如图4所示．在图4(a)中，诱导后样品在6.6× 104处有特异性条带，且条带较粗，实现了目的蛋白的高效表达．在图4(b)中，沉淀样品中存在目的蛋白，上清中基本没有，初步确定蛋白以包涵体式存在于沉淀中，基本不可溶．

包涵体是由于蛋白表达量高、表达速度快等原因造成无法正确折叠而形成的，而E.,coli Rosetta(DE3)是Lac透性酶突变菌株，可以控制表达水平，并提供稀有密码子tRNAs，故选择其作为宿主菌，以期降低目的蛋白表达量．

工程菌E.,coli Rosetta(DE3)-daf-36采用1,mmol/L的IPTG溶液37,℃诱导5,h，SDS-PAGE电泳检测，结果如图5所示．诱导后目的蛋白获得了高效表达，但大部分存在于沉淀中，初步确定蛋白以包涵体式存在于沉淀中，基本不可溶．

2.4 蛋白质谱分析

蛋白质谱结果如图6所示，工程菌表达蛋白与理论序列覆盖率为67%，证明与NCBI中报道[9]的一致，与Yoshiyama-Yanagawa等[10]报道的在果蝇S2细胞中表达的有催化能力的胆固醇7，8–脱氢酶蛋白序列也一致，进一步证明表达的蛋白为胆固醇7，8–脱氢酶．

3 讨 论

目前对于胆固醇7，8–脱氢酶的研究主要集中在酶源发现与功能．本研究选择了来源于秀丽隐杆线虫中的胆固醇7，8–脱氢酶基因daf-36，并进行密码子优化后全序列合成，尝试了两种不同类型菌株作为宿主菌，均提高了该酶外源表达的表达量，其中E.,coli Rosetta(DE3)-daf-36表达量较高．外源基因在大肠杆菌中高效表达时通常主要以不溶性的包涵体形式存在[11–12]．包涵体是致密的不溶性蛋白和RNA的凝聚体，此时的蛋白质往往缺乏活性[13]．本实验中获得的胆固醇7，8–脱氢酶也是包涵体的形式，推测原因可能是其合成速度较快，影响其正确折叠．此外，宿主细胞内的还原性环境也可能影响该酶中二硫

键的形成．在后续的研究中，将尝试包涵体的溶解与复性，或者更换酵母菌等真核表达系统，在实现其表达的前提下，提高酶的活性．

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责任编辑：周建军

Expresion of cholesterol 7，8-dehydrogenase of Caenorhabditis elegans in E. coli

GE Rile，SHEN Yanbin，REN Jiajia，TANG Rui，WANG Min
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

Cholesterol 7，8-dehydrogenase DAF-36 is a key enzyme involved in cholesterol metabolism. In this study，daf-36 gene fromCaenorhabditis eleganswas synthesized. The subcloned daf-36 pET-32a(＋)was to construct the expression plasmid pET32a-daf-36. The recombined plasmid was then transformed into E．coli BL21(DE3)and E. coli Rosetta(DE3). The results of SDS-PAGE and MS showed that the enzyme could be efficiently expressed in the recombined bacteria after being induced by IPTG.

cholesterol 7，8-dehydrogenase gene daf-36；gene cloning；E．coli；protein expression

Q-786

A

1672-6510(2014)05-0024-05

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.05.006

2013–12–08；

2014–01–26

国家高技术研究发展计划“863计划”资助项目(2011AA02A211)；国家自然科学基金资助项目(21276196)

格日勒（1988—），女(蒙古族)，内蒙古呼和浩特人，硕士研究生；通信作者：王 敏，教授，minw@tust.edu.cn.