泛素连接酶Nedd4调控人前列腺癌细胞的增殖与凋亡

周 洁，李玉银，赵昌彩，刁爱坡

(天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

泛素连接酶Nedd4调控人前列腺癌细胞的增殖与凋亡

周 洁，李玉银，赵昌彩，刁爱坡

(天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

为了研究泛素连接酶Nedd4对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响，利用小RNA干扰技术，通过慢病毒包装，侵染前列腺癌细胞DU145，达到下调Nedd4表达的目的．MTT检测表明，下调Nedd4表达可以抑制DU145细胞的增殖；DAPI染色发现，下调Nedd4表达的DU145细胞对星形孢菌素诱导的细胞凋亡更加敏感．这些结果都说明，下调Nedd4的表达不仅可以抑制DU145肿瘤细胞增殖，而且可以促进细胞凋亡．

Nedd4；前列腺癌细胞；细胞增殖；细胞凋亡

泛素连接酶和肿瘤的发生、发展以及转移密切相关[1]．在哺乳动物中，被鉴定的泛素连接酶有600多种．泛素连接酶主要分两大类：RING家族和HECT家族．HECT家族由28种蛋白组成，基于结构的不同，HECT泛素连接酶家族成员多数分属于两个亚家族：Nedd4家族和HERC家族[2]．

Nedd4家族包括9个成员：Nedd4-1、Nedd4-2 (Nedd4L)、ITCH、Smurf1、Smurf2、WWP1、WWP2、NEDL1、NEDL2．这9个成员具有相似的结构，这些结构包括一个N端的C2结构域，中间有2～4个WW结构域，C端的与E6AP(E6 associated protein)[3]同源的COOH端[4]．Nedd4家族泛素连接酶在癌症发生过程中起着重要作用．

在研究基因功能方面，RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术得到广泛应用．RNAi是一种普遍的转录后基因沉默机制，由Fire等[5]于1998年发现．目前，主要通过两条途径来实现RNAi：第一，通过转染短链干扰RNA(short interfering RNAs，siRNA)，实现目的基因沉默；第二，利用表达载体和逆转录病毒进行短链发夹RNA(short hairpin RNAs，shRNA)的转录，完成目的基因表达的降低[6-8]．

无论是转染siRNA还是shRNA的转录，在体内实验和活体实验中[9]，RNAi的作用都可能出现被抑制的现象．Rubinson等[10]利用shRNA慢病毒系统实现了在哺乳动物细胞、干细胞、受精卵及已分化的后代细胞中干扰目的基因表达．shRNA慢病毒系统进行的基因沉默具有高特异性、高稳定性的优点，并且能够在多种细胞及转基因小鼠中实现基因沉默．慢

病毒载体能够快速有效地实现基因沉默，这为基因治疗提供了一种新方法．

李季林等[11]通过瞬时转染shRNA干扰Nedd4-1表达，证明Nedd4-1促进胶质瘤细胞的增殖并且影响细胞凋亡．本研究利用慢病毒载体，稳定下调人前列腺癌细胞DU145中Nedd4的表达，构建稳定细胞系，探讨Nedd4对人前列腺癌细胞增殖及细胞凋亡的调控作用，试图揭示Nedd4在前列腺癌中的功能，探索治疗前列腺癌的新靶点．

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

人前列腺癌细胞DU145、人胚肾上皮细胞系HEK293T，本实验室保藏．Lipofectamine 2000转染试剂，Invitrogen公司；高糖DMEM培养基、RPMI-1640培养基、胎牛血清、Penicilin and Streptomycin、L-Glutamic，Gibco公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)、DMSO，Solarbio公司；Nedd4抗体、β-actin单克隆抗体、干扰质粒载体pLKO.1-Nedd4 shRNA及阴性对照载体pLKO.1-scramble、MISSON Lentiviral Packaging Mix慢病毒包装试剂盒，Sigma公司．

1.2 实验方法

1.2.1 shRNA干扰载体慢病毒包装及检测

根据shRNA设计原则，在Sigma公司共购得5个Nedd4 shRNA目的序列，分别为：

①TRCN0000272424：CCGGCGGTTGGAGAATG TAGCAATACTCGAGTATTGCTACATTCTCCAA CCGTTTTTC；②TRCN0000272425：CCGGAGTGC TACTCGCAGCTATTTACTCGAGTAAATAGCTGCG AGTAGCACTTTTTTC；③TRCN0000272476：CCGG GCTGAACTATACGGTTCAAATCTCGAGATTTGAA CCGTATAGTTCAGCTTTTTC；④TRCN000027 2477：CCGGTACGTGAGAGTGACGTTATATCTCGA GATATAACGTCACTCTCACGTATTTTTC；⑤TRCN 0000284755：CCGGCCGGAGAATTATGGGTGTCAA CTCGAGTTGACACCCATAATTCTCCGGTTTTTC．

利用HEK293T细胞，参照Sigma公司MISSON Lentiviral Packaging Mix说明书进行慢病毒包装，同时包装阴性对照组scramble．收集慢病毒，侵染DU145细胞，Western blot检测Nedd4蛋白表达情况．1.2.2 下调Nedd4表达的DU145稳定细胞系的建立

DU145细胞接种于直径为10,cm的培养皿，等细胞铺展度达到60%～70%，用500,µL慢病毒收集液侵染细胞．阴性对照组用scramble慢病毒收集液侵染DU145细胞．24,h后更换含0.5,µg/mL嘌呤霉素的新鲜培养基进行筛选．此后，待单克隆长至肉眼可见，挑起，转移至新的平板继续培养，然后收集细胞，检测稳转细胞系是否建立成功．

1.2.3 免疫印迹检测Nedd4蛋白表达

收集慢病毒侵染后及阴性对照组DU145细胞，离心弃上清液后，加入50,µL 强RIPA细胞裂解液，于冰浴中裂解20,min，然后于4,℃、13,000,r/min离心10,min．离心后弃沉淀，取蛋白进行SDS-PAGE电泳．电泳完毕，利用半干转膜仪将蛋白转移至PVDF膜上，用质量分数为5%的脱脂奶粉室温封闭1,h，于4,℃下进行一抗孵育过夜．然后用体积分数为0.02%的Tween 20的PBS缓冲液(PBST)漂洗PVDF膜3～5次，每次5,min．洗完后于室温下二抗避光孵育1,h．PBST漂洗3～5次，每次5,min．洗完后，用Odyssey红外激光成像系统成像，以β-actin作对照．1.2.4 MTT检测干扰Nedd4表达对DU145细胞增

殖的影响

实验设置阴性对照组与Nedd4 shRNA实验组，实验组取干扰Nedd4表达的DU145稳定细胞系，每组设3个复孔．96孔板每孔5×103个细胞，用MTT法分别于48、72、96,h用酶标仪测定波长570,nm处吸光度(A)以反映细胞增殖状况．

1.2.5 DAPI染色检测下调Nedd4表达对DU145细胞凋亡的影响

取干扰Nedd4表达的稳定细胞系与阴性对照scramble细胞，接种细胞于盖玻片上，用1.5,µmol/L星形孢菌素分别处理24、48,h；处理完毕后，取出盖玻片，用PBS溶液洗2遍；用质量分数为4%的多聚甲醛固定5,min，再用PBS洗2次；用体积分数为0.2%的Triton,X-100处理10,min，处理完毕后用PBS洗2次，再用质量分数为3%的BSA封闭30,min；封闭完成后，用DAPI染细胞核，室温闭光静置30,min后，用PBS洗3次，最后用封片剂封片，在荧光显微镜下观察．

2 结果与分析

2.1 shRNA干扰载体的慢病毒包装及检测

为了检测不同序列shRNA下调Nedd4蛋白表达的效果，对shRNA干扰载体进行慢病毒包装并侵染DU145细胞，免疫印迹检测DU145细胞内Nedd4蛋白表达，结果如图1所示．

图1中control为空白对照，不含慢病毒；scramble为阴性对照，是以含非靶基因shRNA的pLKO.1载体进行慢病毒包装所得；2424、2425、2476、2477、4755为Nedd4靶基因shRNA的pLKO.1载体进行慢病毒包装所得．如图1所示，序列2425慢病毒收集液对细胞内Nedd4蛋白表达干扰效果最好，序列2424和2477干扰效果次之，序列2476和4755干扰效果最差．所以选用序列2425慢病毒收集液进行后续实验．

2.2 下调Nedd4表达的DU145稳转细胞系的建立

为了检测下调Nedd4表达的DU145稳转细胞系是否构建成功，进行免疫印迹实验，结果如图2所示．与对照相比，用Nedd4 shRNA干扰载体慢病毒侵染的DU145稳转细胞系中Nedd4表达量降低，即干扰Nedd4表达的DU145稳转细胞系构建成功．

2.3 下调Nedd4表达对DU145细胞增殖的影响

利用MTT方法检测下调Nedd4表达对DU145细胞增殖的影响，结果如图3所示．

由图3可知：各组细胞在接种后的96,h，下调Nedd4的DU145细胞数低于对照组(P＜0.01)，说明下调Nedd4表达可以抑制DU145细胞增殖．

2.4 下调Nedd4表达对DU145细胞凋亡的影响

凋亡细胞的细胞核皱缩、形状不规则，荧光染色较正常细胞核浓，有些还会碎裂成块状．利用DAPI染色技术检测下调Nedd4的表达对DU145细胞凋亡的影响，实验结果如图4所示．在接受星形孢菌素处理后，稳定干扰Nedd4表达的DU145细胞核皱缩量明显多于阴性对照组；且48,h后，稳定干扰Nedd4表达的DU145细胞由于凋亡过多，视野中总细胞量减少．这些结果都说明下调Nedd4表达可以促进DU145细胞凋亡．

3 讨 论

前列腺癌是在男性群体中比较常见的一种癌症．研究[12]表明，Nedd4作为泛素连接酶家族中的一员，影响前列腺癌细胞的增殖与凋亡．

本研究采用的慢病毒载体系统是三质粒表达系统，分别为包装质粒、包膜质粒和载体质粒．这个系统利用多质粒表达系统构建载体并且尽量减少质粒间重叠数量，这样可以大大降低通过重组产生可复制性病毒的可能性，提高了慢病毒载体的安全性．

利用慢病毒载体系统包装慢病毒，然后侵染DU145细胞，结果证实Nedd4的shRNA干扰序列TRCN0000272425成功下调了DU145细胞的Nedd4

蛋白表达，且利用该序列包装的慢病毒收集液成功构建干扰Nedd4表达的稳转细胞系(图1和图2)．

原癌基因可以通过抑制细胞增殖或者促进细胞凋亡来影响肿瘤的生长．MTT实验表明，干扰Nedd4表达后，DU145细胞的增殖能力较对照组降低，说明Nedd4能够促进前列腺癌细胞的增殖(图3)．DAPI染色结果显示，下调Nedd4表达后，前列腺癌细胞对星形孢菌素诱导的细胞凋亡的敏感性明显增强，说明下调Nedd4能够促进细胞凋亡(图4)．

Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着重要作用，其中Caspase-3作为关键的执行分子，在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能．Nedd4影响细胞凋亡的过程中，是否发生了Caspase-3酶原的激活及剪切，还有待进一步研究．

PTEN作为抑癌基因，在细胞的生长、分化、死亡方面起着重要作用[13-14]．在多种人类细胞和组织中，PTEN的突变或敲除促进肿瘤发生[15]．PTEN负调控PI3K/Akt信号通路[16]，能够被泛素介导的蛋白酶体降解，在老鼠的模型及多种人类癌症样本中，PTEN的表达水平均明显低于正常细胞表达量，与此同时，Nedd4-1高表达[17-18]，表明Nedd4-1对PTEN具有负调控作用．

相反，也有研究[19]表明敲除Nedd4-1后，并不影响PTEN的降解与它的亚细胞定位．Eide等[20]研究发现，Nedd4在结肠癌细胞中高表达，并且促进癌细胞增殖，但是并不依赖PI3K/PTEN/Akt信号通路，PTEN表达量与Nedd4没有直接关系．这对于进一步证实Nedd4是否作为PTEN的负调控因子并且影响PTEN降解与核转移是一个挑战．

Nedd4参与生长因子受体的调控，包括胰岛素生长因子受体-1(IGF-1,R)、血管内皮生长因子受体-2(VEGF-R2)、上皮生长因子受体(EGFR)等[22-23]. Nedd4敲除后的转基因小鼠的主要表现为生长阻滞，同时小鼠胚胎成纤维母细胞(MEFs)在敲除Nedd4后生长缓慢，并且在血清饥饿处理后，相对于野生型细胞，敲除Nedd4的MEFs反应异常[24]．

Nedd4蛋白家族拥有9个成员，9个成员分别有各自的功能，例如：除Nedd4-1、Nedd4-2以外，Smurf1调控肿瘤细胞运动性、BMP/Smad1通路等；Smurf2通过Smad2和TGF-β 受体抑制TGF-β 信号通路，从而介导完成泛素化降解[25–26]；ITCH作为细胞命运调节因子Notch，调控细胞活动；WWP1参与p53的定位与转录；WWP2是上皮钠离子通道；NEDL1是超氧化物歧化酶1的突变体；NEDL2负责稳定p73及其转录调控等[27]．这9个家族成员在各自主要功能以外是否存在相互之间的功能补充还需要大量的研究来寻求答案．

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责任编辑：周建军

Effects of Ubiquitin Ligase Nedd4 on Human Prostate Cancer Cell Proliferation and Apoptosis

ZHOU Jie，LI Yuyin，ZHAO Changcai，DIAO Aipo
(College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

To study the effects of Nedd4 on tumor cell proliferation and apoptosis，Nedd4 was depleted in prostate cancer cell DU145 by infecting the lentiviruses expression of Nedd4-shRNAs. MTT assay showed that that depletion of Nedd4 decreased DU145 cell proliferation. DAPI staining indicated that knockdown of Nedd4 resulted in greater sensitivity to staurosporine-induced apoptosis of DU145 cells. These results revealed that the down-regulation of Nedd4 expression not only reduced the cell proliferation but also induced the apoptosis of DU145 cells.

Nedd4；prostate cancer cell；cell proliferation；cell apoptosis

R737.25

A

1672-6510(2014)05-0015-05

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.05.004

2013–12–18；

2014–03–31

天津市自然科学基金重点资助项目(10JCZDJC16800)；国家自然科学基金资助项目(31071181)

周 洁（1987—），女，江苏徐州人，硕士研究生；通信作者：刁爱坡，教授，diaoaipo@tust.edu.cn.