新型Caspase-3抑制剂1，2–苯并异噻唑–3–酮–1，4–二取代–1，2，3–三唑类衍生物的合成

刘 伟，郭振飞，燕志慧，卢美琪，杨 诚

(1. 天津科技大学理学院，天津 300457；2. 天津科技大学生物工程学院，天津 300457；3. 天津市国际生物医药联合研究院，天津 300457)

新型Caspase-3抑制剂1，2–苯并异噻唑–3–酮–1，4–二取代–1，2，3–三唑类衍生物的合成

刘 伟1，郭振飞2，燕志慧2，卢美琪3，杨 诚3

(1. 天津科技大学理学院，天津 300457；2. 天津科技大学生物工程学院，天津 300457；3. 天津市国际生物医药联合研究院，天津 300457)

为探究对Caspase-3有更高抑制活性的非肽类小分子抑制剂，用“点击反应”合成了一系列1，2–苯并异噻唑–3–酮–1，4–二取代–1，2，3–三唑类衍生物．通过体外Caspase-3和Caspase-7抑制活性测试发现，化合物7c对Caspase-3有最好的抑制活性，IC50达到11.0±1.2,nmol/L．为了更好的理解这些化合物与Caspase-3蛋白的相互作用模式，进行了分子对接实验．结果表明，化合物7c与蛋白作用位点具有很好的结合模式，验证了该化合物具有很好的体外Caspase-3抑制活性．

抑制剂；1，2–苯并异噻唑–3–酮；分子对接；点击反应；Caspase-3

凋亡或程序性细胞死亡是细胞组织发展和保持内环境稳定的重要生理过程．正常的细胞凋亡是机体必须的代谢过程，但是细胞的非正常凋亡往往会引发各种各样的病症，例如：神经退行性疾病，缺血性损伤，自身免疫性疾病及癌症[1]．Caspase家族参与细胞凋亡的整个过程，已发现的15种Caspase蛋白可以分为3类：Caspase-1、-4、-5、-11参与白介素前体活化，与细胞炎症有关；Caspase-2、-8、-9、-10等是凋亡上游调节子，是凋亡起始者；Caspase-3、-6、-7是凋亡的执行者[2]．其中，Caspase-3在细胞凋亡中起着关键的作用．许多疾病都与Caspase-3的异常激活有关，因此，Caspase-3蛋白被认为是1个有药物开发前景的靶点，Caspase-3抑制剂的研究也成为了热点．

依据Caspase-3蛋白底物的特异性，目前已设计并合成了大量肽类和非肽类抑制剂．大部分肽类抑制剂对Caspase-3有很高的抑制活性，IC50一般在纳

摩尔级别[3–5]，但是肽类抑制剂代谢稳定性差、细胞渗透性差等因素限制了其应用．这就促使了对非肽类抑制剂的研究．例如：以5–硝基靛红为母核合成了一系列的衍生物，个别衍生物对Caspase-3的IC50在纳摩尔级别[6–7]．喹啉酮和异喹啉酮类化合物也被证实对Caspase-3有很好的抑制活性，IC50在微摩尔至毫摩尔范围[8]．最近，本研究组[9]通过高通量筛选发现了1个对Caspase-3有抑制活性的母核，1，2–苯并异噻唑–3–酮(IC50＝46.7,µmol/L)．经结构修饰，发现其衍生物对Caspase-3有很好的抑制活性，IC50达到31,nmol/L，但是该系列化合物水溶性差，仍需继续进行结构改造．

近年来，三唑合成因“点击反应”的特异性、高产率等特点在药物化学中倍受青睐[10]．此外，在分子中引入1，2，3–三唑基团有如下好处：(1)1，2，3–三唑是肽键的生物等排体；(2)1，2，3–三唑代谢稳定，并能形成氢键，从而提高水溶性，有利于药物与其目标的结合；(3)1，2，3–三唑可连接2个药效团，得到1种创新双官能团药物，这在构建生物活性分子和功能分子中起到了越来越重要的作用；(4)1，2，3–三唑及其衍生物是非常重要的药物化学模型，具有生物活性多样性，如抗结核、抗HIV和抗菌等．此外，在已报道的Caspase-3抑制剂文献中，1，2，3–三唑也被引入活性分子中，用于结构改造．例如：在2008年，Ng等[11]报道了1，2，3–三唑类衍生物作为Caspase-3抑制剂，其活性都在微摩尔级别．最近，Robert等[7]报道了靛红1，4–二取代的1，2，3–三唑类化合物作为Caspase-3抑制剂，发现抑制活性最好的衍生物的IC50达到了4.5,nmol/L．因此，本文将1，2，3–三唑环引入1，2–苯并异噻唑–3–酮类Caspase-3抑制剂结构中，希望可以进一步提高该类化合物对Caspase-3的体外抑制活性，还同时评估了其对同族蛋白Caspase-7的体外抑制活性．

1 材料与方法

1.1 主要原料

1，2–苯并异噻唑–3–酮、抗坏血酸钠、三光气、丙炔氨、各种取代苯胺等，分析纯，购自北京百灵威科技有限公司．

用于分别检测化合物对Caspase-3和Caspase-7体外抑制活性的四肽荧光底物Ac-LDEVD-AMC和 Ac-DEVD-AMC，购自上海吉尔生化有限公司．

甲醇、三乙胺、二氯甲烷及四氢呋喃等溶剂，分析纯，购自北京化学试剂公司，使用前均经重蒸除水.

1.2 仪器

循环水式真空泵，河南省予华仪器有限公司；集热式恒温加热磁力搅拌器，郑州长城科工贸；低温恒温反应浴，巩义市京华仪器有限公司；Avance DPX–400,MHz核磁共振仪，瑞士Bruker公司；傅里叶变换红外光谱仪，珀金埃尔默仪器有限公司．

1.3 实验方法

1.3.1 目标化合物的合成方法

取代苯胺(4,mmol)、0.552,g(8,mmol)亚硝酸钠溶于15,mL水中，冷却至0,℃，并滴加15,mL (12,mmol)HCl溶液，搅拌30,min即得化合物2溶液；向上述溶液中滴加15,mL叠氮化钠(0.312,g，4.8,mmol)水溶液，反应4,h后用二氯甲烷萃取，收集有机层，并旋除二氯甲烷，得到有机叠氮产物3[12]．

将溶于40,mL二氯甲烷的1.28,g(40,mmol)丙炔氨逐滴加入溶于40,mL二氯甲烷的三光气溶液中，并滴加6,mL三乙胺，反应12,h后旋除溶剂；将残余物溶于40,mL二氯甲烷中，并滴入溶有3.02,g (20,mmol)1，2–苯并异噻唑–3–酮的20,mL四氢呋喃溶液中，反应12,h后旋除溶剂；将固体溶于30,mL丙酮与30,mL水的混合溶剂中，抽滤，所得固体为末端炔化合物6．

将0.650,g(2.8,mmol)末端炔、4,mmol有机叠氮溶于30,mL甲醇中，并加入催化剂CuSO4(0.032,g，0.2,mmol)和抗坏血酸钠(0.08,g，0.4,mmol)．室温反应12,h，旋除溶剂，硅胶柱层析分离得目标1，2，3–三唑类化合物(7a—7n)．目标化合物的合成路线如图1所示．

1.3.2 Caspase-3蛋白及Caspase-7蛋白的体外酶活测定

Caspase-3抑制剂的检测方法参考文献[9]．本实验中的Assay buffer：0.1% CHAPS，50,mmol/L HEPES(pH 7.5)，100,mmol/L NaCl，10% glycerol，1,mmol/L EDTA；底物：Ac–LDEVD–AMC．详细操作如下：在室温的条件下，在96孔板中放入人重组Caspase-3蛋白，并孵育10,min，加入2,µL溶于DMSO的一定浓度的抑制剂，然后加入2,µL底物Ac–LDEVD–AMC，收集荧光值10,min，依据所收集的荧光数据计算出该化合物的15个浓度梯度的剩余活性，然后用GraphPad Prism 5作图分析，横坐标为化合物浓度的常用对数值，纵坐标为剩余活性．然后计算出各个化合物的IC50．

人重组Caspase-7酶活测定实验条件与上述Caspase-3的类似，只是底物改为Ac–DEVD–AMC．1.3.3 化合物7c与Caspase-3蛋白的分子对接

为了探究抑制剂与Caspase-3蛋白活性位点间的相互作用以及结合模式，将抑制Caspase-3活性最好的化合物7c在Schrödinger Suite 2010软件中采用格莱德标准进行分子对接．从PDB蛋白质网站选取与Caspase-3蛋白共晶的小分子化合物(PDB ID code 3,H0E)作为参照．并且，按以下方式处理蛋白：去掉所有的硫酸根离子、水分子；优化氢键网络；用LigPrep2.4处理配体，用OPLS2005力场处理配体的局部电荷，并产生蛋白初始的3,D结构；以配体为中心，建立1个“盒子”，大小为1.2,nm．

2 结果与讨论

2.1 化合物7c的表征结果

抑制活性最好的化合物7c的核磁图谱如图2所示．化合物7c的结构表征数据如下：收率0.72,g，70%；白色固体；熔点209.2～209.8,℃；1H NMR (400,MHz，DMSO)δ 9.36(t，J＝6.0,Hz，1,H)，8.74(s，1,H)，8.03(d，J＝8.4,Hz，1,H)，7.97～7.93(m，3,H)，7.80(t，J＝7.6,Hz，1,H)，7.52～7.42(m，3,H)，4.71(d，J＝6.0,Hz，2,H)；13,C NMR(100,MHz，DMSO)δ 164.9，162.1(d，J＝244,Hz)，151.3，145.9，141.3，134.5，133.7(d，J＝3,Hz)，127.0，126.5，125.1，122.8(d，J＝8,Hz)，122.6，121.93，117.2(d，J＝23,Hz)，36.1；IR：3,295，1,699，1,665，1,516；ESIMS：369.99(M＋H)+．

其他目标化合物的表征图谱和表征数据略．

2.2 生物活性测试

以先前合成的1，2–苯并异噻唑–3–酮衍生物[9]作为阳性对照，对一系列1，4–二取代–1，2，3–三唑类衍生物进行了活性评估，其IC50值见表1．

由表1可以看出：大部分化合物对Caspase-3和Caspase-7的抑制活性都在纳摩尔级别；在所合成的目标化合物中，7c对Caspase-3和Caspase-7都有很好的抑制活性，IC50分别是11.0±1.2,nmol/L和5.2± 0.4,nmol/L，7,m对Caspase-3和Caspase-7有最低的抑制活性，IC50分别是6,830±560,nmol/L和16,730 ±2.7,nmol/L；有趣的现象是目标化合物对Caspase-7的抑制活性普遍比Caspase-3的高，例如：7b和7c对Caspase-3的抑制活性分别为IC50＝15.0±0.9,nmol/L和11.0±1.2,nmol/L，而7b和7c对Caspase-7的抑制活性分别为IC50＝7.1±0.5,nmol/L和5.2± 0.4,nmol/L，Chu等[7]在2011年也报道了类似结果；化合物7,j对Caspase-3的抑制活性大约是化合物7,i对Caspase-3的抑制活性的5倍，而对于Caspase-7的抑制活性，化合物7,j大约为化合物7,i的8倍；引入1，2，3–三唑基团后，化合物7,c对Caspase-3的抑制活性是阳性对照的3倍左右．

2.3 分子对接

为了阐明1，2，3–三唑化合物的生物活性，以便引导今后的结构改造，将化合物7c与Caspase-3蛋白进行了分子对接．为方便比较，将共晶抑制剂和阳性对照也与Caspase-3蛋白进行了对接，如图3所示．

由图3(a)可知：Caspase-3的活性位点包括S1、S2、S3、S4共4个口袋．共晶抑制剂小分子很好地填充在了4个口袋里面，在S1口袋里面，共晶抑制剂的嘧啶与主链上H121的羰基形成了氢键，共晶抑制剂的羰基和磺酰基与主链上C163和R207上的NH分别形成了2个氢键；另外，共晶抑制剂的吡咯环和苯氧环在S3、S4口袋里面也有疏水作用．

由图3(b)可知：与共晶抑制剂结合模式相似，化合物7c很好地填充在S1、S2、S3口袋里面，脲结构上的羰基和NH与R207和T62在S2口袋里面形成了3个氢键；7c的苯并异噻唑上的苯环深深地插入了疏水的S3口袋，形成了很强的疏水作用；而且，7c的对氟基苯环与F128残基有π-π共轭．综上所述，7c与Caspase-3有很好的结合，验证了它对Caspase-3蛋白有非常好的体外抑制活性．

由图3(c)可知：与化合物7c的对接模型相似，阳性对照也是很好地填充在S1、S2、S3口袋里面，脲结构上的羰基和NH与R207和H121形成了3个氢键．但是，它的乙基苯环仅与Y204、W214上面的2个苯环形成弱的疏水作用．因此，化合物7c的活性是阳性对照的3倍左右．

3 结 语

本文合成了一系列结构新颖的1，4–二取代的

1，2，3–三唑类化合物，并对其进行了分子水平的活性评价．首先，探究了它们对Caspase-3和Caspase-7的体外酶活活性，结果表明目标化合物对Caspase-3和Caspase-7的活性普遍达到纳摩尔级．其次，分子对接实验表明，化合物7c与Caspase-3蛋白可以形成多个氢键，并有很强的疏水和π-π堆积作用，良好的结合效果佐证了其具有很好的体外抑制活性．这些实验结果为Caspase-3抑制剂的结构改造提供了方向．

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责任编辑：常涛

Synthesis of 1，2-benzisothiazol-3-one-derived 1，2，3-triazoles as a Novel Class of Caspase-3 Inhibitors

LIU Wei1，GUO Zhenfei2，YAN Zhihui2，LU Meiqi3，YANG Cheng3
(1. College of Science，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；
2. College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；
3. Tianjin International Joint Academy of Biotechnology and Medicine，Tianjin 300457，China)

In order to get a non-peptide inhibitor with higher inhibitory activities against caspase-3，a series of 1，2-benzisothiazol-3-one-derived 1，4-disubstituted 1，2，3-triazoles was prepared using the “click reaction” and evaluated as inhibitors against caspase-3，-7. The most potent caspase-3 inhibitor was found to be 7c with IC50-values of 11.0± 1.2,nmol/L. Moreover，in order to better rationalize the action and the binding mode of these compounds，docking studies were carried out. The result suggests that there is good binding mode between 7c and caspase-3,protein.

inhibitor；1，2-benzisothiazol-3-one；docking；click reaction；caspase-3

R914.2

A

1672-6510(2014)05-0010-05

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.05.003

2014-03-04；

2014-05-21

国家自然科学基金青年基金资助项目(21302139)

刘 伟（1978—），男，天津人，副教授，liuwei2006@tust.edu.cn.