尿素醇解反应的影响因素及动力学研究

张 健，刘国新，张 颖，刘 浩

(1. 工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457；

2. 食品营养与安全教育部重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457)

尿素醇解反应的影响因素及动力学研究

张 健1，刘国新1，张 颖2，刘 浩1

(1. 工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457；

2. 食品营养与安全教育部重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457)

针对尿素和乙醇反应体系，采用Box-Behnken设计研究反应温度、体系pH和乙醇体积分数对氨基甲酸乙酯生成的影响，并根据反应机理，建立了尿素和乙醇亲核取代反应生成氨基甲酸乙酯的表观动力学方程．结果表明，高温、高乙醇体积分数和较小的pH有利于氨基甲酸乙酯的生成．通过建立的模型可以很好地预测尿素–乙醇–水三元体系中氨基甲酸乙酯的生成量，但在真实酒样中，该模型对氨基甲酸乙酯含量的预测值为实测值的66.4%～86.5%，从动力学的角度证明干红葡萄酒中尿素为氨基甲酸乙酯的主要前体，但并非唯一前体．

尿素；乙醇；氨基甲酸乙酯；动力学

尿素又称碳酰二胺、碳酰胺、脲，广泛存在于发酵食品中．除了原料引入和人为添加外，酿酒酵母的氮代谢亦是发酵食品中尿素的主要来源[1]．已有大量研究[2-4]发现，尿素和乙醇在自然条件下可反应生成氨基甲酸乙酯(EC)，而EC是国际癌症研究机构认定的2A类致癌物，受到联合国粮农组织的重点监控[5]. 虽然EC的前体物质很多，但尿素被认为是EC的主要前体[6]，从某种意义来说，尿素的含量可以反映发酵食品中潜在的EC含量．

关于尿素和乙醇的反应过程，国内外报道的不多. 1988年，Ough等[7]曾对比多种的氨甲酰化合物(包括尿素)与乙醇生成EC的反应过程，发现酸性条件和高温环境有利于该类反应的进行．此后，又有学者[8]研究了不同贮藏时间和温度对葡萄酒中EC生成的影响，其重点也是监测尿素和乙醇的反应．现已知尿素和乙醇生成EC的反应过程受体系pH、乙醇体积分数、反应温度和时间等因素的影响，但已有的报道缺乏对这些影响因素的深入研究以及对该反应的

动力学描述．为此，本文将深入研究不同因素对该反应体系的影响，从动力学的层面对反应进行合理地解释，建立相应的动力学方程，并尝试将该动力学方程应用于实际葡萄酒样品的EC含量预测中．

1 材料与方法

1.1 原料及试剂

干红葡萄酒，市售；尿素、无水乙酸、酒石酸，分析纯；乙酸钠、浓盐酸，化学纯；氨基甲酸乙酯(纯度大于99%)、9-羟基吨(纯度大于99%)，Sigma公司；无水乙醇、乙腈，色谱纯；娃哈哈纯净水．

1.2 实验方法

1.2.1 影响因素实验

本研究采用Box-Behnken设计[9]研究尿素和乙醇的亲核取代反应，系统研究温度、pH和乙醇体积分数对氨基甲酸乙酯生成的影响．实验因子水平的选取见表1．体系pH调节采用酒石酸，尿素质量浓度固定为500,mg/L，反应时间为6,d．

1.2.2 动力学研究

在体积分数为11.5%的乙醇水溶液中加入一定量尿素，至尿素质量浓度为50,mg/L，采用1,mol/L的酒石酸溶液调节体系pH为3.5，此即为简单的红酒模拟体系．将该体系样品分别置于283、303、343,K的温度条件下保存0、10、20、30、40、50、60,d，取样测定尿素和氨基甲酸乙酯质量浓度，拟合相应的动力学参数．

随机选取3种市售红酒，分别测定初始尿素和EC的质量浓度，然后将3种红酒置于343,K的温度条件下密封保存20、40、60,d，测定EC的质量浓度，验证动力学方程．

1.3 分析方法

采用HPLC-FLD法[10]测定尿素和EC质量浓度．取600,µL样品和400,μL 9–羟基吨溶液，加入100,µL 1.5,mol/L稀盐酸后振荡摇匀，在30,℃避光条件反应30,min，反应后的样品经0.22,µm的有机膜过滤后进行色谱分析．

1.4 模型参数拟合方法

采用Origin Pro 8.1进行曲线拟合，模型参数的求解由最小二乘法拟合实验数据得到．

2 结果与讨论

2.1 不同条件对反应过程的影响

不同的反应条件，如pH、反应温度、体系基质等都会对特定的化学反应产生影响．对于尿素和乙醇的亲核取代反应，亦有一些相关的报道探讨各因素的作用；但已有的研究多为单因素实验，对于不同因素的交互作用探讨的不多．因此，本研究采用Box-Behnken设计，试图用较少的实验得到较多的信息，尤其是单因素实验无法探究的各因素之间的交互作用信息．实验结果见表2．

对表2中实验数据进行多项式回归分析，拟合所得二次方程为Y＝10,798.86＋7,750,X1－1,109.11,X2＋213.06,X3＋5,376,X12＋335.05,X1,X2＋305.84,X1,X3＋551.26,X22＋257.73,X2,X3＋219.64,X32，回归方程的方差分析见表3．由表3可知：该模型极显著(P＜0.01)，而且经分析计算该模型的确定系数2R＝0.997,9，表明模型拟合很好．温度、pH对EC质量浓度的线性效应显著；且温度对EC质量浓度的曲面效应也显著；乙醇体积分数以及各因素的交互影响不显著．温度和乙醇体积分数对EC的生成影响都是正效应，即温度的升高或乙醇体积分数的增大有利于EC的生成；而pH的影响是负效应，较小的pH有利于EC的生成，这与Stevens等[4]的报道一致．

2.2 动力学方程的建立

尿素和乙醇的反应可以用式(1)[11]来表示.

根据式(1)可知，1,mol的尿素与1,mol的乙醇反应生成1,mol的氨基甲酸乙酯，假若反应完全进行且反应过程中没有物料损失，可以根据尿素的消耗速率来推算EC的生成速率．然而，实际情况并非如此，尿素在本反应体系中还会发生水解反应，而在酒类饮料中可能发生的反应更为复杂．如果反应体系中的尿素是EC的唯一前体，则体系中EC的含量可以用式(2)表示.

式中：1k为由尿素生成EC的反应速率常数，d-1；ECρ为EC质量浓度，µg/L；ureaρ为尿素质量浓度，µg/L；t为反应时间，d．

假设尿素分解的反应级数为1级，则urealnρ应与时间t成线性相关．分别以283、303、343,K的实验数据进行拟合，用最小二乘法进行线性回归，其线性复相关系数分别为0.947,4、0.931,7、0.947,5．由此可知，反应级数为1的假设是成立的，故以下均以1级为准确定尿素分解反应的动力学方程及活化能．典型的1级动力学方程可用式(3)表示．

式中：2k为尿素分解反应速率常数，d-1．

式(3)积分得

将式(4)代入式(2)得到EC生成的动力学方程．

根据不同时间实测的尿素质量浓度拟合方程(式(3))可以求出2k，将2k代入式(5)，再根据不同时间实测的EC质量浓度可以拟合求得1k，结果见表4.

由表4可知：在所选的温度条件下，该模型与实验数据的相关系数(2R)均在0.93以上，证明本文所提出的动力学模型与实验值吻合良好，能够用来预测EC随时间的变化规律．为了预测任意温度下EC随时间的变化规律，引入了Arrhenius方程．

式中：k为反应速率常数；0k为指前因子；aE为表观活化能；R为通用气体常数．

对Arrhenius方程两边取对数，可得

以lnk为纵坐标，1/T为横坐标作图，回归后可得到lnk与1/T的关系式．对于k1，关系式为lnk1= 12.05−4 656.9/T ；对于k2，关系式为lnk2=7.55−4 382.9/T．由此可得，尿素生成EC反应的表观活化能Ea=38.7,kJ/mol，指前因子k0为2.683×105,mL/ (mol·d)；尿素分解反应的表观活化能Ea=36.4,kJ/ mol，指前因子k0为1.9×103,mL/(mol·d)．

根据Arrhenius方程，可以求出任意温度条件下的k1和k2，因此只要知道尿素和EC的初始质量浓度，就可以根据式(5)预测不同时间内EC的质量浓度．为了验证方程的预测能力，按照1.2.2中的方法

处理3种酒样后，比较EC质量浓度的预测值和实测值，结果见表5．

结果表明：EC预测结果普遍偏低13.5%～33.6%，即预测值为实测值的66.4%～86.5%．本研究中动力学方程是基于尿素和乙醇的醇解反应，并且假设尿素为EC的唯一前体而建立的．事实上，除尿素外，有报道[11]认为瓜氨酸和氨甲酰磷酸等物质都是EC的潜在前体，只是此类物质对EC形成的贡献很小．本实验所用酒样中很可能存在除尿素外的其他EC前体，也许这就是导致该方程应用于实际酒样中预测结果偏低的原因．另外，本研究是基于模拟体系(乙醇体积分数为11.5%，pH 3.5)的动力学建模，而实际红酒样品中的乙醇体积分数和pH并不固定，一般乙醇体积分数为10%～13%，而pH为3.2～3.6．因此，乙醇体积分数和pH的不确定性也可能会对方程EC含量的预测形成干扰，包含这些干扰因素的更为复杂的动力学模型还有待进一步研究．

3 结 论

尿素和乙醇的亲核取代反应，在高温、低pH和高乙醇体积分数条件下更易进行，会生成较多的EC，但各因素间的交互影响作用并不明显．在283～343,K的温度范围内，尿素和乙醇亲核取代反应的表观活化能为38.7,kJ/mol，而尿素分解反应的表观活化能为36.4,kJ/mol．通过建立的模型可以很好地预测尿素–乙醇–水三元体系中EC的生成量；但在真实酒样中，该模型对EC含量的预测值为实测值的66.4%～86.5%．本研究从动力学的角度证明干红葡萄酒中尿素为EC的主要前体，但并非唯一前体．

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责任编辑：周建军

Influencing Factors and Kinetics of Urea Alcoholysis Reaction

ZHANG Jian1，LIU Guoxin1，ZHANG Ying2，LIU Hao1
(1. Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；
2. Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

The effect of temperature，pH，and ethanol on urea alcoholysis reaction was studied using Box-Behnken experimental design. An apparent kinetics model of the urea reaction with ethanol to form ethyl carbamate was developed based on the reaction mechanism. Results indicate that the high temperature，high ethanol content and low pH value are conducive to the formation of ethyl carbamate. The predicted value of the ethyl carbamate fits well with the measured values in ureaethanol-water system，but fits poorly in the real wine samples. In fact，the predicted values are only 66.4% to 86.5%of the measured values. It suggests that the urea is the main precursor of ethyl carbamate，but not the only one in red wine，from the view of kinetics.

urea；ethanol；ethyl carbamate；kinetics

O643.1

A

1672-6510(2014)05-0006-04

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.05.002

2013–12–20；

2014–03–25

国家自然科学基金资助项目(31101275，31201354)

张 健（1978—），男，甘肃兰州人，副研究员；通信作者：刘 浩，教授，liuhaokd@tom.com.