BAG-1S和 COX-2基因在非小细胞肺癌中的表达及其对预后的意义

孙晓艳，王亚帝，何东宁，李 萍，哈敏文

肿瘤细胞对化疗的敏感性和耐受性存在个体差异，可能是导致化疗失败、病情进展的重要原因。目前，国内外已对非小细胞肺癌(NSCLC)相关的多种化疗预后因子进行了研究，为NSCLC的分子分型及个体化治疗提供了实验依据，但有些预后因子的特异性并未达到理想的效果，研究结果仍存在争议，如BAG-1蛋白。BAG-1蛋白能与多种基因蛋白产物相作用，调节细胞增殖和凋亡。BAG-1基因编码的产物BAG-1蛋白有4个异构体，均是由1条mRNA链通过选择性剪切翻译而成的，其中3个主要的异构体是BAG-1L、BAG-1M和BAG-1S蛋白。BAG-1蛋白虽是抗凋亡蛋白，但其对预后的意义有一定争议，认为与BAG-1蛋白的优势亚型有关。王慧等[1]研究发现在大肠癌中BAG-1L蛋白表达水平越高，其恶性程度越高，临床预后越差；Millar等[2]认为浸润性导管癌的核型BAG-1蛋白即BAG-1L蛋白的高表达提示局部复发、远处转移率低，其预后较好；Rorke等[3]研究发现在NSCLC细胞质中BAG-1蛋白的高表达与患者生存期的延长相关。环氧化酶-2(COX-2)蛋白在多种肿瘤组织中高表达，能促进癌细胞的增殖，延缓凋亡，致使癌症患者预后较差。郭琰[4]通过对胃癌细胞的研究发现COX-2蛋白能够激活上调Bcl-2蛋白的表达。BAG-1蛋白促进抗细胞凋亡的能力也是通过与Bcl-2形成复合物并上调Bcl-2蛋白的表达，最终使生存期延长。BAG-1与COX-2蛋白可能通过某种通路影响NSCLC的预后。

本研究采用免疫组化法和RT-PCR技术检测BAG-1蛋白的不同亚型及COX-2蛋白在NSCLC中的表达，探讨NSCLC的BAG-1预后优势亚型，探讨联合检测BAG-1与COX-2蛋白的表达对NSCLC预后的指导意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2009年1月—2010年1月于辽宁医学院附属医院行肺癌手术且术后行6～8个周期化疗的120例NSCLC患者的手术病理标本，其中男62例，女58例，年龄45～76岁，中位年龄66岁；鳞癌54例，腺癌66例；高分化癌46例，中分化癌31例，低分化癌43例；按临床术后外科病理分期(p-TNM)分为Ⅰ期22例、Ⅱ期42例、Ⅲ期56例(美国癌症联合委员会2002年分期标准)；无淋巴结转移者45例，有淋巴结转移者75例。从化疗结束开始每3个月对患者行电话随访1次，随访截止日期为2013年6月。根据临床随访资料进行回顾性研究，分析BAG-1S和COX-2蛋白表达与性别、年龄、病理类型、分化程度、病理分期和有无淋巴结转移的关系。

1.2 BAG-1蛋白和COX-2蛋白表达的检测 采用免疫组化法检测BAG-1蛋白和COX-2蛋白的表达，鼠抗BAG-1多克隆抗体(CC9E8，工作稀释度为1∶15)购自Santa Cruz，兔抗COX-2多克隆抗体工作液、SP免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术公司。按SP免疫组化试剂盒说明书进行操作。

1.3 BAG-1S mRNA表达的检测 采用石蜡包埋组织提取RNA及RT-PCR方法检测BAG-1S mRNA的表达。石蜡包埋组织40 μm，EASY spin石蜡包埋组织RNA快速提取试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司(目录号 RN30)，PrimeScript RT-PCR Kit购自大连宝生物工程有限公司(DRR014A)。

1.4 结果判定 BAG-1蛋白和COX-2蛋白表达：于免疫染色最多的区域计数1 000个肺癌细胞，观察细胞着色程度，计算其阳性细胞百分数。着色强度评分：无色(-)为0分，浅黄色(+)为1分，棕黄色(++)为2分，深棕色(+++)为3分；阳性细胞百分数评分：0为0分，<25 %为1分，26 %～50 %为2分，51 %～75 %为3分，76 %～100 %为4分。细胞着色强度与阳性细胞百分数得分之和≥3分即为免疫组化染色阳性。PCR产物：10 μl扩增产物在1 % 琼脂糖(Agarose)凝胶(含有EB)中150 V电泳30 min，同时以5 μl标准分子量DNA Marker 2 000 bp作为参照，电泳结束后，紫外灯下观察结果并照相。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行数据分析，率的比较采用χ2检验；BAG-1S和COX-2蛋白表达的相关性采用Spearman秩相关分析；绘制生存曲线，生存数据的分析采用Kaplan-Meier法，组间比较采用Log-rank检验；采用Cox回归模型进行生存期的多因素分析，纳入的自变量为年龄、性别、病理类型、分化程度、病理分期、淋巴结转移、BAG-1S蛋白表达和COX-2蛋白表达；以P<0.05为差异有统计学意义，均为双侧检验。

2 结果

2.1 BAG-1蛋白和COX-2蛋白表达 BAG-1蛋白在胞质及胞核均有表达，共有103例阳性表达，单独在胞质表达41例，单独在胞核表达12例，在胞质和胞核同时表达50例。COX-2蛋白主要在胞质表达，共有67例阳性表达，阳性表达率为55.8%(见图1～6)。

2.2 RT-PCR产物 BAG-1S mRNA阳性表达73例，阳性表达率为60.8%(见图7)。

图7 BAG-1S mRNA阳性表达Figure 7 The positive expression of BAG-1S mRNA

2.3 BAG-1S蛋白和COX-2蛋白表达与临床特征的关系 不同分化程度NSCLC患者BAG-1S蛋白阳性表达率比较，差异有统计学意义(χ2=10.551，P=0.005)；不同病理类型及淋巴结转移患者COX-2蛋白阳性表达率比较，差异有统计学意义(χ2=9.069、7.320，P=0.003、0.007，见表1)。

图1 BAG-1蛋白在胞质表达(SP法，×400)
Figure1 BAG-1 protein expression in the cytoplasm

图2 BAG-1蛋白在胞质、胞核同时表达(SP法，×400)
Figure2 BAG-1 protein expression in the cytoplasm and the nucleus

图3 BAG-1蛋白在胞核表达(SP法，×400)
Figure3 BAG-1 protein expression in the nucleus

图4 BAG-1蛋白表达阴性对照(SP法，×400)
Figure4 BAG-1 protein expression in the negative control

图5 COX-2蛋白在胞质表达(SP法，×400)
Figure5 COX-2 protein expression in the cytoplasm

图6 COX-2蛋白在胞核表达(SP法，×400)
Figure6 COX-2 protein expression in the nucleus

表1 不同临床特征患者BAG-1S和COX-2蛋白阳性表达率比较〔n(%)〕Table 1 Comparison of BAG-1S and COX-2 protein positive expression rate in patients with different characteristics

2.4 生存曲线比较 BAG-1S蛋白阳性表达、BAG-1L/M蛋白阳性表达、BAG-1蛋白阴性表达患者的总生存期(OS)、无进展生存期(PFS)分别为39.482、36.414、35.806个月，25.760、24.235、23.925个月。BAG-1S蛋白阳性表达、BAG-1L/M蛋白阳性表达、BAG-1蛋白阴性表达患者的OS、PFS比较，差异均有统计学意义(χ2=37.191、35.051，P<0.001)，BAG-1L/M蛋白阳性表达与BAG-1蛋白阴性表达患者的OS、PFS比较，差异均无统计学意义(χ2=1.220、1.209，P=0.269、0.272，见图8、9)。

COX-2蛋白阳性与阴性表达患者的OS(37.671、39.007个月)、PFS(24.861、25.520个月)比较，差异均有统计学意义(χ2=4.605、4.232，P=0.032、0.040，见图10、11)。

BAG-1S、COX-2蛋白单独阳性表达及二者同时表达的OS(41.516、35.948、38.330个月)、PFS(26.805、24.056、25.173个月)比较，差异均有统计学意义(χ2=31.246、28.442，P<0.001，见图12、13)。

图8注：OS=总生存期

图8 BAG-1不同亚型蛋白表达患者的OS曲线
Figure8 OS curves of patients in BAG-1 protein expression with different subtypes

图9注：PFS=无进展生存期

图9 BAG-1不同亚型蛋白表达患者的PFS曲线
Figure9 PFS curves of patients in BAG-1 protein expression with different subtypes

图10 COX-2蛋白阳性表达与阴性表达患者的OS曲线
Figure10 OS curves of patients in COX-2 positive expression or not

图11 COX-2蛋白阳性表达与阴性表达患者的PFS曲线
Figure11 PFS curves of patients in COX-2 positive expression or not

图12 BAG-1S、COX-2各自阳性表达及二者同时阳性表达患者的OS曲线
Figure12 OS curves of patients in BAG-1S,COX-2 respectively positive expression and both are positive expression

图13 BAG-1S、COX-2各自阳性表达及二者同时阳性表达患者的PFS曲线
Figure13 PFS curves of patients in BAG-1S,COX-2 respectively expression and both are positive expression

2.5 Spearman秩相关分析 BAG-1S蛋白与COX-2蛋白的表达呈正相关(r=0.180，P=0.049)。

2.6 Cox回归分析 Cox回归分析显示BAG-1S蛋白、COX-2蛋白、分化程度、病理分期及淋巴结转移是NSCLC患者生存期的影响因素(见表2)。

表2 NSCLC患者生存期的Cox回归分析Table 2 Cox regression analysis of survival time for NSCLC patients

3 讨论

病理组织分型曾是预测NSCLC治疗效果的重要指标。但目前随着分子生物学及遗传学的进展，逐渐认识到肿瘤的发生发展不仅在病理，而且在遗传及基因表型等方面同样具有异质性，目前结合分子生物学标记等预测指标，已成为指导NSCLC临床个体化治疗及预测疗效的重要研究方向。

BAG-1基因是一种抗凋亡基因，其编码产物能与多种基因蛋白产物相互作用，调节细胞增殖和凋亡。BAG-1蛋白在多种恶性肿瘤中高表达，但表达的意义不尽相同[5-10]。Dzhagalov 等[11]发现 BAG-1蛋白表达阴性的肺癌患者PFS和OS明显延长。但Rorke等[3]研究发现，BAG-1蛋白阳性表达组患者的PFS及5 年生存率均高于阴性表达组。考虑可能与BAG-1蛋白的优势亚型有关，不同亚型的BAG-1蛋白过表达在细胞中的分布与肿瘤患者预后之间的关系仍有争议。Rorke等[3]发现胞质中BAG-1蛋白表达情况与较长的OS相关。而汪小沅[12]得出的结论与Rorke相反，其认为肿瘤胞核中BAG-1蛋白的过表达与死亡风险减低相关。本研究发现BAG-1蛋白在NSCLC中高表达，其中BAG-1S蛋白是NSCLC患者的预后优势亚型，可以延长患者的预后生存期，而BAG-1L/M蛋白对患者的预后无影响，BAG-1L/M蛋白阳性表达者的期与阴性表达者间无明显差异，年龄、性别、病理类型、病理分期及淋巴结转移对BAG-1S蛋白的表达无影响。

BAG-1基因是抗凋亡基因,理论上该蛋白的高表达会导致患者的预后较差,而部分研究的结论恰恰相反,对于这一矛盾，Dzhagalov等[11]推测可能与不同个体内BAG-1不同亚型蛋白的表达有关。这种矛盾关系在Bcl-2的抗凋亡活动中同样存在[13]。本研究发现BAG-1S蛋白在NSCLC组织中高表达，是NSCLC患者的预后优势亚型，但其具体作用机制有待于进一步研究。

大量研究表明COX-2蛋白在大多数肿瘤中高表达，Jiang等[14]通过Meta分析得出COX-2蛋白的表达状态是NSCLC的独立预后因素，并与肿瘤的发生、发展和预后有关。COX-2蛋白在细胞周期调控中起重要作用，其过表达会抑制细胞分裂。研究发现其过表达与肿瘤侵袭性和不良预后有关[15-16]。本研究结果显示：COX-2蛋白在NSCLC中高表达，病理类型及淋巴结转移可能是其表达的影响因素，而其阴性表达患者的预后生存期明显长于阳性表达者。

本研究显示：BAG-1S与COX-2蛋白在NSCLC中的表达呈正相关，BAG-1S蛋白、COX-2蛋白、分化程度、病理分期及淋巴结转移对患者的生存期有影响。BAG-1S及COX-2蛋白同时阳性表达的患者生存期明显长于单独COX-2蛋白阳性表达者，但低于单独BAG-1蛋白阳性表达者。吴倩等[17]、Wang等[18]和 Liu等[19]报道，BAG-1基因在NSCLC中的表达可能与铂类药物的化疗敏感性相关。本研究患者均接受化疗药物治疗，可能导致BAG-1S及COX-2蛋白对化疗药物的敏感性增加。

BAG-1基因是抗凋亡基因，但本研究发现BAG-1S蛋白阳性表达具有生存优势，可能是其对化疗药物敏感所致；COX-2蛋白同样具有重要的预后作用。BAG-1S及COX-2蛋白既是预后的独立影响因素，又能相互作用影响。因此，在肿瘤的临床治疗中，可以联合检测BAG-1S、COX-2蛋白预测NSCLC预后，又可以根据两因子的相互关系指导临床个体化治疗，延长患者的生存时间。

本研究未对BCL-2蛋白进行检测，今后的研究中将对BAG-1S及COX-2相关通路进行研究，并研究BAG-1S的作用机制。

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