通心络对糖尿病大鼠心肌成纤维细胞PCNA的影响❋

张常喜，杨爱萍，谢春毅

(1.宁夏回族自治区中医医院内科，银川 750021； 2.上海市中西结合医院，上海 200082)

通心络胶囊具有益气活血、通络止痛、清热解毒之功效，临床上对于多种心血管疾病均有一定的治疗效果。糖尿病心肌病是糖尿病的主要并发症之一，而心肌纤维化是导致糖尿病心肌病变的一个主要因素[3]。大量实验证明，通心络对血脂、内皮素ET-1有很好的调整作用，且能抑制心肌组织的纤维化[1～3]。通心络还能明显改善糖尿病(DM)大鼠心功能和心肌病理情况，减少心肌胶原容积分数，降低心肌MMP-9、TIMP-1与TGF-B1 蛋白的表达及含量，进而起到预防糖尿病心肌病的作用[4]。本实验拟通过观察通心络对糖尿病心肌病变大鼠血糖、PCNA的影响，探讨通心络对糖尿病心肌纤维化防治的作用靶点。

1 材料

1.1 动物

清洁级SD雄性大鼠60只，平均体质量(210±20)g，由上海复旦大学动物实验中心提供(许可证号SCXK沪2002-0002)。动物饲养温度25℃，湿度40%。

1.2 药品、试剂与仪器

通心络胶囊由石家庄以岭药业股份有限公司提供，增殖细胞核抗原(PCNA)购自美国Santa Cruz公司，天狼猩红、链脲佐菌素为Sigma公司产品，苦味酸购自上海钰森生物技术有限公司，血糖试纸购自德国罗氏公司。

万能研究用显微镜(日本Olympus公司型号BX51型)，图像分析系统(德国ZEISS公司，Axioskop2 plus)，图像分析软件(IMAGE-PRO PLUS (VER 4.1))，德国罗氏公司的G1ucolxend血糖仪。

2 方法

2.1 动物分组

雄性SD大鼠60只，随机取17只作为对照组，正常饲养，不给予特殊处理。其余43只SD大鼠禁食12 h后，按55 mg/kg体质量腹腔内注射浓度为1 mg/ml的链脲佐菌素(STZ)，注射72 h后大鼠尾尖采血，罗氏血糖仪测定空腹血糖。血糖值>16.7 mmol/L，伴有多饮、多食和多尿者确定为糖尿病(DM) 模型大鼠。其中7只血糖升高但不合格者，按30 mg/kg体质量腹腔内注射链脲佐菌素，72 h后再测最终造模成功。40只大鼠按随机数字表法分为模型组和通心络治疗组2组，每组再各分8周和12周2个时间段组，每组10只。对照组、模型组每天给予2 ml生理盐水灌胃，通心络治疗组给予通心络胶囊中的药粉按1.0 g/kg-1·d-1浓度稀释于2 ml生理盐水中灌胃。实验共持续12周，每4周监测血糖1次。实验过程中因造模失败与灌胃不当剔除7只大鼠，最终53只大鼠纳入统计。除对照组大鼠外，糖尿病组及各药物组大鼠均出现多食、多饮、多尿、消瘦、体质量减轻等症状，在实验周期内大鼠未发现酮症酸中毒表现者。

2.2 取材

分别于8周和12周2个实验点，给予实验动物腹腔注射1%戊巴比妥钠进行麻醉处理，腹主动脉采血约10 ml分离血清备用，处死大鼠并取出心脏剔除心房，留取心室肌组织，称重后10%甲醛固定，24 h后逐级脱水、石蜡包埋、5 μm厚切片，进行病理、免疫组化检测。

2.3 检测项目及方法

2.3.1 免疫组化染色测心肌PCNA% 免疫组化染色测心肌组织中PCNA的表达，用鼠抗体PCNA结合抗原后行免疫组化染色，阳性指数测PCNA%。心肌细胞核内棕黄色颗粒为PCNA的抗原抗体复合物；切片于光镜下200倍放大，采用图像分析软件对染色阳性物质进行测定，计算PCNA 阳性细胞百分比(阳性细胞数占视野中所有细胞总数的百分比)，每张片子随机选择6个视野，取其均数。

2.3.2 心肌胶原检测 对制备好的心肌组织采用天狼猩红染色，组织中红色为阳性胶原，采用图像分析软件对染色阳性物质进行测定：测定灰度均值和阳性面积百分比(红色胶原占视野中组织的百分比)，每张片子随机选择6个视野取其均数。

2.4 统计学方法

采用SPSS 12.0软件进行统计分析，多样本均数比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组糖尿病大鼠血糖变化

表1 各组糖尿病大鼠血糖值比较(mmol/L)

注：与对照组比较:##P<0.01

表1显示，实验过程中模型组与通心络治疗组大鼠血糖水平均明显高于对照组(P<0.01)，通心络8周治疗组血糖水平略低于模型组，但差异无统计学意义(P>0.05)，通心络治疗组血糖水平与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)

3.2 各组心肌组织免疫组化染色后PCNA的变化

表2图1显示，模型8周、12周组心肌PCNA%较正常大鼠增加，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)；模型组心肌PCNA%，12周组较8周组明显增加 (P<0.01)；通心络治疗组心肌PCNA%较模型组明显减少(P<0.01)，通心络治疗12周组PCNA%较8周组有所增加，但差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组心肌组织免疫组化染色后PCNA百分比(%)

注：与对照组比较:#P<0.05，##P<0.01;与模型组比较:△△P<0.01;与8周组比较：＊＊P<0.01

3.3 各组大鼠心肌胶原表达比较

表3 各组大鼠心肌胶原表达百分比(%)

注：与对照组比较：#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较:△P<0.05

表3显示，实验8周、12周时，模型组大鼠心肌胶原表达明显高于对照组(P<0.01)。通心络8周、12周治疗组大鼠心肌胶原表达分别明显低于模型8周、12周组(P<0.05)。

4 讨论

PCNA是DNA聚合酶δ的附属蛋白，与细胞增殖有关，参与DNA合成，分子量36 KD，是仅能在增

图1 PCNA免疫组化染色(×200)

殖细胞中合成和表达的核内多肽链。PCNA是DNA合成不可缺少的物质，而DNA合成是细胞增殖周期中的关键，PCNA的合成与表达和细胞增殖周期相关，于G1晚期出现，S期达高峰，G2期下降，M期及G0期无表达。因此，PCNA的合成及表达与细胞的增殖状态、分化活跃程度有关，是一个敏感的检测指标，被广泛用于细胞增殖功能的检测[5]。

目前PCNA已被应用于研究心肌细胞和心肌成纤维细胞的增殖活性[6]。本实验发现，糖尿病对心肌的主要影响为促进心肌胶原的沉积，导致心肌的纤维化。有研究发现，心肌的纤维化除发生心肌成纤维细胞的增殖外，亦存在心肌细胞的增殖，但心肌细胞增殖的比例非常低[7]。成纤维细胞是心肌细胞外基质的主要来源，其功能和心肌重塑、心肌纤维化有密切关系[8]，心肌成纤维细胞的增殖是心肌纤维化的主要因素，PCNA的表达可以较准确地反映心肌成纤维细胞的增殖状态[9]。

本实验发现，糖尿病对心肌的主要影响为促进胶原的增生沉积，从而导致心肌的纤维化。本研究发现，糖尿病8周组、12周组PCNA的表达明显高于对照组，且12周组高于8周组，说明随着糖尿病的进展成纤维细胞的增生越来越明显，其增生促进了胶原的增生沉积。陈东明等[10]也通过实验证明，成纤维细胞促进心肌胶原表达。本实验发现，通心络对糖尿病大鼠的血糖无明显降低作用，但能明显抑制糖尿病大鼠心肌胶原[3],同时能明显抑制心肌PCNA的表达，说明通心络是在成纤维细胞增殖水平上抑制了糖尿病心肌的纤维化。本研究初步说明，通心络对糖尿病心肌纤维化病变有良好的预防作用。

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