酸雨对全生育时期水稻叶绿素荧光的影响

王 雯，李 曼，王丽红，周 青

江南大学环境与土木工程学院，江苏 无锡 214122

WANG Wen, LI Man, WANG Lihong, ZHOU Qing*

School of Environmental and Civil Engineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

酸雨对全生育时期水稻叶绿素荧光的影响

王 雯，李 曼，王丽红，周 青*

江南大学环境与土木工程学院，江苏 无锡 214122

酸雨是全球关注的重大环境污染问题之一，中国亦继西欧和北美之后，成为当今世界第三大酸雨区。光合作用是植物生物量和作物经济产量形成的生理基础，叶绿素荧光常用来判断逆境胁迫对植物光合作用造成的伤害。有研究表明，酸雨会对植物叶绿素荧光造成影响，然不同生长阶段植物对逆境的抵抗能力亦存在差异，采用模拟酸雨（酸雨pH值梯度为4.5、3.5、2.5）或模拟天然降水持续胁迫（每隔3天喷施1次）水稻（Oryza sativa）（从幼苗期至灌浆期），利用原位无损伤叶绿素荧光测定技术（德国Walz公司PAM-210脉冲调制式荧光仪）分别探测和分析幼苗期、分蘖期、孕穗期和灌浆期水稻叶片（处理组和对照组），研究酸雨对全生育期水稻叶绿素荧光的影响，相关研究未见报道。结果表明，与CK相比，pH 4.5酸雨使幼苗期和孕穗期初始荧光(Fo)显著提高了7.69%、8.84%，使幼苗期、分蘖期和孕穗期非光化学猝灭参数(qN)显著提高了8.64%、4.86%、6.09%，使幼苗期和孕穗期最大光化学量子产量(Fv/Fm)，PSII电子传递速率(ETR)，实际原初光能捕获效率(ΦPSII)，光化学猝灭参数(qP)显著降低，幼苗期、孕穗期降幅依次为Fv/Fm(3.01%、6.88%)、ETR(8.40%、10.24%)、ΦPSII(8.39%、12.23%)、qP(3.79%、12.55%)；pH 3.5、pH 2.5酸雨不同程度地显著降低了各生育时期Fv/Fm、ETR、ΦPSII、qP，幼苗期和孕穗期qN，显著提高了各生育时期Fo，且随酸雨pH值降低，变化幅度增大。同时，pH 4.5或pH 3.5酸雨持续胁迫下，水稻受到伤害大小规律为灌浆期＜幼苗期＜分蘖期＜孕穗期；pH 2.5酸雨持续胁迫下，水稻受到伤害大小规律为分蘖期＜幼苗期＜灌浆期＜孕穗期。总之，酸雨胁迫强度与水稻叶绿素荧光参数存在剂量-效应关系，酸雨持续胁迫会对不同生育时期水稻光合作用造成影响，并且不同生育时期水稻光合作用对酸雨胁迫敏感性存在差异，这些是评价酸雨胁迫对植物影响时需考虑因素。

酸雨；水稻；全生育期；持续胁迫；叶绿素荧光

酸雨(Acid rain，AR)是当代全球重大环境问题之一，受到广泛关注(Menz和Seip，2004)。继西欧和北美之后，中国已成为当今世界第三大酸雨区(Larssen等，2006)。中国酸雨区主要分在长江以南和青藏高原以东(解淑艳等，2012)，且近年来酸雨污染仍有加重趋势(环境保护部，2010)。众多研究表明酸雨会直接或间接影响作物生长发育和产量(Hu等，2009；Koricheva等，1997；Wood和Bormann，1974；Wyrwicka和Skłodowska，2006；Yu等，2002；童贯和，2005)。光合作用是植物体内中心同化路径，是植物生物量和作物经济产量形成的生理基础。研究酸雨对作物光合作用的影响理应更受关注。叶绿素荧光作为光合作用研究的探针，可以用来评价光合作用主要的光合化学反应、PSII效率和电子载体上电子传递效率(Kummerová等，2006)，推测光合作用中心PSI与PSII的结构是否受到破坏等。目前国际上植物体内叶绿素荧光动力学的研究已成为热点，并在逆境生理研究中得到广泛应用(Kooten和Snel，1990；Massacci等，1995)。Vialita等通过叶绿素荧光参数研究表明，pH 1.8模拟酸雨造成菜豆(Phaseolus vulgaris)PSII失活，电子传递受阻，光能利用率降低(Velikova等，1999)。Sun等(Sun等，2012)通过叶绿素荧光参数研究发现镉和酸雨复合胁迫阻碍了大豆(Glycine max)幼苗叶片光能吸收，电子传递，光能转化等过程。

作物的生长不仅受到外界胁迫的影响，还与作物自身生长发育时期密切相关。逆境生物学研究表明，不同生长阶段植物对逆境的抵抗能力亦存在差异(Kooten和Snel，1990)模拟酸雨分别处理拔节期(姚桃峰等，2010)、孕穗期(王润年等，2011)和灌浆期(姚桃峰等，2010)小麦(Triticum aestivum Linn)，发现其对光合特性的影响不同，表明酸雨胁迫不同生育时期植物，光合速率发的变化不同。然而，在酸雨区，持续生长在酸雨环境中的作物各生育时期光合作用会发生怎样的变化尚不清楚。这往往会给准确评价污染物致害效果，并由此建立该污染物的环境安全相关结论造成困难。水稻作为重要的粮食作物，是国内外科学家作物研究的焦点(Liu等，2013；Nakamura等，2013；Niu等，2013；Yang等，2013)。鉴于此，本文以水稻为试材，采用叶绿素荧光技术，研究持续酸雨胁迫对全生育时期水稻叶绿素荧光的影响，为科学评价酸雨对全生育期植物环境安全性提供基础实验数据与参考。

1 材料方法

1.1 试材培养

挑选籽粒饱满水稻(Oryza sativa，淮稻8号)种子，用0.1% HgCl2消毒10 min，去离子水冲洗去除表面残留HgCl2，去离子水浸泡后置于25 ℃恒温光照培养箱中催芽2 d，将发芽种子移入苗床，待幼苗长至两叶一心时移入周转箱(320 mm×215 mm×100 mm)中水培，周转箱上置15穴的泡沫板，每穴定植2株水稻幼苗，营养液每隔3 d更换1次，直至三叶一心。

营养液采用国际水稻研究所(IRRI)常规营养液配方并略作修改(Zhu等，2009)。Fe以Fe-EDTA形式配入并保持营养液中Fe质量浓度为2.00 mg·L-1，同时加入NaSiO3·9H2O保持营养液中SiO2质量浓度为120 mg·L-1，NH4+-N中加入5.89 mg·L-1双氰胺作为硝化抑制剂，用H2SO4或NaOH将营养液pH调至5.5。

1.2 模拟酸雨配置和实验处理

根据中国酸雨现状和趋势，选择3个酸雨pH值2.5、3.5、4.5，并以pH 5.5为对照(CK)。根据东南地区天然降水离子水平(孔然等，2012)，去离子水中分别添加一定量CaCl2、NaCl、K2SO4、NH4NO3作为模拟天然降水，其中Ca2+，Na+，K+，Mg2+，SO42-，NO3-和Cl-含量分别为0.83、1.32、0.15、5.34、0.36、0.64、0.47、0.69和1.80 μmol·L-1。用体积比为1.1∶1的硫酸和硝酸配制pH 1.0酸雨母液(孔然等，2012；解淑艳等，2012)。用酸雨母液调节模拟天然降水pH值至2.5、3.5和4.5，并经FE-20实验pH计校准(Yoshida等，1971)，作为喷施的酸雨溶液。并用酸雨母液调节营养液至pH 4.5，3.5，2.5作为培养酸性营养液。

培育至三叶一心后，将水稻幼苗移入含酸性营养液的蛭石中持续酸雨胁迫处理，同时对叶面喷淋与营养液pH值相同的模拟酸雨溶液，CK喷施模拟天然降水，每隔3 d喷1次酸雨，根据东南地区降雨量和蒸发量，计算得每盒每次喷淋酸雨300 mL，每3 d补加1次营养液。

1.3 指标测定

各生育时期选取主茎上完全展开的第1、2片水稻叶子进行测定，每个处理组重复测定3次。实验采用德国Walz公司生产的PAM-210脉冲调制式荧光仪进行水稻叶片活体荧光测定。实验测定前首先将叶片暗适应20 min，照射检测光(＜0.05 μmol·m-2·s-1)后测得初始荧光Fo，照射饱和脉冲光(12000 μmol·m-2·s-1)测得最大光化学量子产量Fv/Fm，打开内源光化光 (180 μmol·m-2·s-1)后，一次照射检测光合饱和脉冲光(1个脉冲)，每隔一定时间测定光适应下荧光参数及荧光猝灭曲线，待实际原初光能捕获效率ΦPSII(作用光存在时PSII的原初光能捕获效率)稳定后，关闭作用光，立即照射远红外光，光化学猝灭参数qP、非光化学猝灭参数qN、PSII的电子传递速率ETR也由仪器自动计算给出。

1.4 数据处理

各处理组与对照组设置3次重复，所有数据为3次独立试验平均值±标准误差(Mean±SD)，运用SPSS 16.0软件，通过LSD检验(P＜0.05)分析处理间的差异显著性。

2 结果

2.1 酸雨对幼苗期荧光参数的影响

表1显示了酸雨对幼苗期水稻叶绿素荧光参数的影响。与CK相比，pH 4.5酸雨使Fv/Fm，ETR，ΦPSII，qP显著降低，qN、Fo显著升高；pH 3.5酸雨使Fv/Fm、ETR、ΦPSII、qP、qN显著降低，Fo显著升高；pH 2.5酸雨使Fv/Fm、ETR、ΦPSII、qP、qN显著降低，Fo显著升高。

2.2 酸雨对分蘖期荧光参数的影响

表2显示了酸雨对分蘖期水稻叶绿素荧光参数的影响。与CK相比，pH 4.5酸雨使qP显著降低，Fv/Fm、ETR、ΦPSII、Fo变化不显著，qN显著升高；pH3.5酸雨使Fv/Fm、ETR、ΦPSII、qP显著降低，qN变化不显著，Fo显著升高；pH2.5酸雨使Fv/Fm、ETR、ΦPSII、qP、qN显著降低，Fo显著升高。

2.3 酸雨对孕穗期荧光参数的影响

表3显示了酸雨对孕穗期水稻叶绿素荧光参数的影响。与CK相比，pH 4.5酸雨使Fv/Fm、ETR、ΦPSII、qP显著降低，Fo、qN显著升高；pH 3.5酸雨使Fv/Fm、ETR、ΦPSII、qP、qN显著降低，Fo显著升高；pH 2.5酸雨使Fv/Fm，ETR，ΦPSII，qP，qN显著降低，Fo显著升高。

表1 酸雨对幼苗期水稻叶绿素荧光参数的影响Table1 Effects of acid rain on chlorophyll fluorescence parameters in rice at seedling stages

表2 酸雨对分蘖期水稻叶绿素荧光参数的影响Table2 Effects of acid rain on chlorophyll fluorescence parameters in rice at tillering stages

表3 酸雨对孕穗期水稻叶绿素荧光参数的影响Table3 Effects of acid rain on chlorophyll fluorescence parameters in rice at booting stage

表4 酸雨对灌浆期水稻叶绿素荧光参数的影响Table4 Effects of acid rain on chlorophyll fluorescence parameters in rice at filling stage

2.4 酸雨对灌浆期荧光参数的影响

表4显示了酸雨对灌浆期水稻叶绿素荧光参数的影响。与CK相比，pH 4.5酸雨处理下，Fo、Fv/Fm、ETR、ΦPSII、qP、qN变化均不显著显著；pH 3.5酸雨使Fv/Fm、ETR、ΦPSII、qP显著降低，qN变化不显著显著，F0显著升高；pH 2.5酸雨使Fv/Fm、ETR、ΦPSII、qP、qN显著降低，Fo显著升高。

3 讨论

叶绿素荧光反应可通过无损伤原位叶片测定方法快速测定逆境污染胁迫下植物叶片叶绿素荧光参数，用以评价光合机构功能和环境胁迫对植物的影响，探明光合机构受影响的部位(Speranza等，2011；李晓等，2006；苏行等，2002)，广泛应用于逆境胁迫对植物光合作用影响的研究(洪涛等，2005)。初始荧光Fo是PSII反应中心全部开放时的荧光，其升高源于PSII反应中心可逆或不可逆失活(李霞等，2002)；Fv/Fm是最大光化学量子产量，反映PSII反应中心原初光能转换效率，正常条件下该参数不受物种和生长条件影响，逆境时明显下降(郭春芳和孙云，2006)；ΦPSII是环境胁迫下，PSII反应中心部分关闭时的实际原初光能捕获效率，亦为PSII反应中心光化学反应实际效率；ETR反映实际光强下的表观电子传递效率。qP和qN均增加有利于逆境中对光合系统起到保护作用，qP降低表明光能转化效率和通过PSII的能流减少，必然会使光合电子传递能力减弱，叶片暗反应受阻；qN降低表明PSII的保护机制受到损伤，而过剩激发能会进一步对PSII中心造成伤害(Sharma等，1998)。

水稻幼苗期，pH 4.5酸雨胁迫下Fo和qN升高，Fv/Fm、ΦPSII、ETR、qP下降，表明pH 4.5酸雨导致水稻幼苗PSII反应中心损坏，光合电子传递受阻，光合作用受抑制，通过增加热耗散来消除因光化学效率降低所累积的过量光能(李晓等，2006)，与前人提出的“PSII反应中心受损会减弱电子传递和增加热耗散来耗散过量光能而保护PSI”( Arbinson等，1990)的观点一致，推测原因可能是较高浓度H+影响了水稻叶绿体功能，进而对PSII造成影响。当酸雨pH降至3.5或2.5时，水稻幼苗Fo升高，Fv/Fm、ΦPSII、ETR、qP和qN下降，PSII活性中心和保护机制受损，且随酸雨pH值降低损害加重，表明酸雨(pH 3.5和pH 2.5)导致过量活性氧累积，细胞抗氧化能力降低(Livingstone等，2001)，光合色素及类囊体膜受损(Hattab等，2009)，光能利用效率降低，QA-重新氧化为质体醌QA的量减少，电子传递能力下降，而过剩激发能也会进一步对PSII中心造成伤害，最终降低了光合作用(Qiu等，2013)。这可能是处于幼苗期的水稻根少叶小，光合产物较少，叶绿体中PSII易受酸雨污染影响，当受到较高强度酸雨胁迫时，光合系统易受到伤害，表现为水稻叶绿素荧光反应对酸雨胁迫较为敏感。

水稻分蘖期，pH 4.5酸雨持续胁迫下Fo、Fv/Fm、ΦPSII、ETR无显著差异，qP下降，qN升高，表明pH 4.5酸雨胁迫下，PSII捕获的光能不能充分地转化为植物所需要的化学能将其用于光化学反应，多余的光能以热的形式耗散掉，启动了能量耗散机制来保护光合机构以免于受到酸雨胁迫的伤害(Horton等，1991；Demmig-Adams等，1990；Demmig-Adams和Adams等，1992)，且下降幅度小于幼苗期，这可能由于分蘖期水稻生长代谢旺盛，抗逆能力随着酸雨持续胁迫并未小于幼苗期所致。当酸雨pH值降至3.5或2.5时，水稻分蘖期Fo升高，Fv/Fm、ΦPSII、ETR、qP、qN下降，表明水稻的PSII原初光能转化率降低，光合电子传递受阻，热耗散机制未启动，导致光合作用受抑制，且下降幅度小于幼苗期，表明高强度酸雨下分蘖期水稻抗逆性大于幼苗期，这可能由于水稻分蘖期属于旺盛生长的营养生长期，不断出叶和分蘖，发根能力强，根群生命力强，故抗逆性较幼苗期强，PSII受酸雨影响没有幼苗期敏感。

水稻孕穗期，在pH 4.5、3.5和2.5酸雨持续胁迫下Fo均升高，Fv/Fm、ΦPSII、ETR、qP均下降，而qN在pH 4.5酸雨胁迫时升高，在pH 3.5和2.5酸雨胁迫时下降，随pH值降低降幅增大，表明随酸雨pH值的降低，孕穗期水稻PSII受损越来越严重；且同pH值酸雨胁迫时，孕穗期各指标幅度变化均大于幼苗期和分蘖期，表明孕穗期对酸雨胁迫最敏感，这可能由于孕穗期水稻叶层发生功能分工，酸雨导致的下层叶片早枯影响了根部对矿质元素和N素的吸收，进而影响了水稻的抗逆性和适应性，表现为叶片PSII对酸雨污染敏感。

水稻灌浆期，pH 4.5酸雨持续胁迫下各指标均无显著差异，pH 3.5酸雨持续胁迫下Fo升高，Fv/Fm、ΦPSII、ETR、qP下降，qN无显著差异，且出现灌浆期上述各指标变化幅度小于幼苗期、分蘖期和孕穗期，即pH 4.5或3.5酸雨持续胁迫下水稻受到伤害大小规律为灌浆期＜幼苗期＜分蘖期＜孕穗期。这有可能是灌浆期水稻已完成营养生长，进入生殖生长后期，生长发育趋于稳定，对酸雨胁迫耐受性强；还可能由于长时间的酸雨胁迫使水稻对酸雨的抗逆性增强所致。而pH 2.5酸雨持续胁迫下灌浆期水稻Fo升高，Fv/Fm、ΦPSII、ETR、qP、qN下降，与其他三生育期相比，水稻受到伤害大小规律为分蘖期＜幼苗期＜灌浆期＜孕穗期，这可能由于pH 2.5酸雨使水稻叶片PSII严重受损，酸雨持续胁迫至灌浆期造成更严重的伤害，从而表现为灌浆期水稻受伤害最严重。

酸雨胁迫下，pH 4.5酸雨显著影响了幼苗期，孕穗期叶绿素荧光参数，对分蘖期和灌浆期叶绿素荧光参数无显著影响。pH 3.5酸雨却不同程度造成各生育时期水稻荧光参数的显著变化，故此pH值下它们的变化程度可以用来辨别各生育期间抗性差异，实验结果表明孕穗期水稻最敏感。

4 结论

酸雨污染胁迫下，酸雨酸度与水稻叶片叶绿素荧光反应存在剂量-效应关系；对比不同生育期水稻荧光参数变幅可知，酸雨对孕穗期水稻荧光参数影响最大，孕穗期水稻最敏感，表明不同生育时期水稻光合作用对酸雨胁迫抗性存在差异。同时持续酸雨胁迫下，酸雨对不同生育时期水稻光合作用的影响也会发生改变，特别是高强度酸雨胁迫(pH 2.5酸雨)，这些是评价酸雨对植物胁迫时需考虑因素。

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Effects of acid rain on the chlorophyll fluorescence reaction in rice at the whole growth stages

Acid rain is one of the global environmental issues. China has become the third largest acid rain region behind Western Europe and North America. Photosynthesis is the physiological basis of biomass and yield formation of plants, and chlorophyll fluorescence is commonly used for evaluating the damage of stress to photosynthesis of plants. Previous studies showed that acid rain influences the chlorophyll fluorescence of plants. However, the stress resistance of plants varies with the growth stage of plants. In the present work, the effects of acid rain on chlorophyll fluorescence of rice (Oryza sativa) at the whole growth stages (from seedling stage, tillering stage, booting stage and filling stage) were investigated, and none relevant reports have been published so far. Rice (from seedling stage to filling stage) were continuously treated with simulated acid rain (pH value of acid rain were 4.5, 3.5, 2.5) or control rain (sprayed every three days). The control leaves and acid rain-treated leaves of rice were sampled at seedling stage, tillering stage, booting stage and filling stage, respectively, to measure the chlorophyll fluorescence parameters with an in situ nondestructive testing technology (pulse modulation Chlorophyll Fluorometer PAM-210, Heinz Walz GmbH, Germany). The results showed that when rice was treated with acid rain at pH 4.5, initial fluorescence (Fo) at seedling stage and booting stage were significantly increased 7.69% and 8.84%, non-photochemical quenching coefficient (qN) at seedling stage, tillering stage and booting stage were significantly increased 8.64%, 4.86% and 6.09%, maximal chlorophyll fluorescence (Fv/Fm), electron transport rate of PSII (ETR), effective quantum yield of photochemical energy conversion of PSII (ΦPSII), photochemical quenching coefficient (qP) at seedling stage and booting stage were significantly decreased, the decreased degrees were 3.01% and 6.88% (Fv/Fm), 8.40% and 10.24% (ETR), 8.39% and 12.23% (ΦPSII), 3.79% and 12.55% (qP), respectively. Acid rain at pH 3.5 and pH 2.5 significantly decreased the Fv/Fm, ETR, ΦPSII, qP and qN in rice at whole stages except increases in the qN at booting stage/filling stage and Fo at all stages of rice, moreover, the change degrees were increased as the pH value of acid rain was decreased. In addition, when rice was continuously treated with acid rain at pH 4.5 or pH 3.5, the extents of damage to rice at different growth stages showed the following order: filling stage ＜seedling stage ＜tillering stage ＜booting stage, however, when rice was continuously treated with acid rain at pH 2.5, the extents of damage to rice at different growth stages showed the following order: tillering stage ＜seedling stage＜filling stage ＜booting stage. In conclusion, acid rain performed a dose-effect relationship on chlorophyll fluorescence parameters in rice. The continued stress of acid rain had obvious effects on photosynthesis in rice at whole stages, but the sensitivity of photosynthesis in rice to the stress of acid rain varied with the growth stage of rice. These differences should be considered in evaluating the effects of acid rain on plants.

acid rain; rice; whole growth stages; sustained; chlorophyll fluorescence

WANG Wen, LI Man, WANG Lihong, ZHOU Qing*

School of Environmental and Civil Engineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

X503.231

A

1674-5906（2014）01-0080-06

王雯，李曼，王丽红，周青. 酸雨对全生育时期水稻叶绿素荧光的影响[J]. 生态环境学报, 2014, 23(1): 80-85.

WANG Wen, LI Man, WANG Lihong, ZHOU Qing. Effects of acid rain on the chlorophyll fluorescence reaction in rice at the whole growth stages [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2014, 23(1): 80-85.

国家自然科学基金项目(31170477)；江苏省教育厅研究生创新基金(CXLX12_0735)

王雯(1989年生)，女，硕士研究生，研究方向为环境生态学。E-mail：wangwensmil@163.com

*通信作者：周青(1957年生)。E-mail：zhouqeco@126.com

2013-11-25