细菌培养法与核酸(荧光PCR法)检测肺炎克雷伯菌的对比分析

杨剑，刘剑荣，黄永建

(萍乡市人民医院检验科，江西萍乡337055)

·实验研究·

细菌培养法与核酸(荧光PCR法)检测肺炎克雷伯菌的对比分析

杨剑，刘剑荣，黄永建

(萍乡市人民医院检验科，江西萍乡337055)

目的探讨培养及核酸检测两种不同方法进行肺炎克雷伯菌检测分析的相关性，为临床提供及时准确的结果。方法对本院68例疑似肺炎克雷伯菌感染病人采集送检的痰标本，采用细菌培养法及核酸(荧光PCR法)检测，结果进行对比统计分析。同时对荧光PCR法的特异性和敏感性进行研究。结果在68例痰标本中肺炎克雷伯菌检出的结果，常规细菌培养法检出阳性33例，阴性35例，阳性率48.53%；荧光PCR法检出阳性49例，阴性19例，阳性率72.06%。对肺炎克雷伯菌标本DNA检测得扩增产物，对非肺炎克雷伯菌无交叉反应，其检测敏感性为1×103copies/ml。结论荧光PCR法检出肺炎克雷伯菌的阳性率高于常规细菌培养法，具有很高的敏感性和特异性，检测时间短，能为临床诊断提供及时准确的结果。

肺炎克雷伯菌；细菌培养法；荧光PCR法

克雷伯菌属为肠杆菌科中一类有荚膜的革兰阴性杆菌，本属中肺炎克雷伯菌、臭鼻克雷伯杆菌和鼻硬结克雷伯菌与人类关系密切。其中肺炎克雷伯菌占克雷伯菌属感染的95%以上。该菌存在于人类肠道、呼吸道以及水和谷物。当机体免疫力降低或长期大量使用抗生素导致菌群失调时，进入人体可引起肺炎、尿路感染、败血症、伤口感染、脑膜炎等多种疾病[1，2]。

近十来年发展的分子生物学技术，特别是聚合酶链反应(PCR)在临床应用上越来越受到青睐，且不断在推广，使得临床细菌感染后快速、准确诊断成为可能。本文对本院68例疑似肺炎克雷伯菌感染病人采集送检的痰标本，通过细菌培养及核酸PCR检测两种不同方法对肺炎克雷伯菌进行检测分析，比较两种方法的相关性，同时对荧光PCR法的特异性和敏感性进行观察，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源本院68例疑似肺炎克雷伯菌感染病人采集送检的痰标本密闭送检，同一患者标本多次分离同样细菌按一株算。

1.2 仪器和试剂VITEK32全自动细菌分析仪鉴定，鉴定卡由生物梅里埃公司提供。肺炎克雷伯菌核酸测定试剂盒(荧光PCR法)由上海之江生物科技股份有限公司提供。本科室PCR实验室已通过国家卫生部验收。

1.3 方法

1.3.1 常规细菌培养检测肺炎克雷伯菌将送检的痰标本分别接种于血平板、巧克力平板、中国兰平板、TTC-沙氏。放于37℃培养箱培养。巧克力平板置5%CO237℃培养箱培养。培养18～24h后做进一步鉴定。并用标准株大肠埃希菌ATCC25922作为质控株[3]。严格按照《全国临床检验操作规程》第3版操作[4]。

1.3.2 核酸检测(荧光PCR法)严格按照肺炎克雷伯菌核酸测定试剂盒(荧光PCR法)说明书进行操作。包括标本、对照品的核酸裂解处理，试剂配制，加样，PCR扩增，阈值设定，质量控制，试验结果计算。进行定量检测时，阳性参考品(1×107copies/ml)进行10、100和1000倍梯度稀释，试验结束后，仪器自动生成标准曲线。

1.3.3 特异性试验将培养为肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、化脓性链球菌、白念珠菌的痰标本分别用肺炎克雷伯菌核酸测定试剂盒(荧光PCR法)进行DNA提取检测。

1.3.4 敏感性试验将肺炎克雷伯菌阳性参考品(1×107copies/ml)进行10倍梯度稀释成：106copies/ ml、105copies/ml、104copies/ml、103copies/ml、102copies/ml、101copies/ml，然后进行DNA提取检测[5]。

1.4 统计学方法分析两种方法的阳性检出率比较采用四格表资料的χ2检验，P＜0.05为差异有统计学差异。

2 结果

2.1 肺炎克雷伯菌检出情况在68例痰标本中肺炎克雷伯菌检出的结果，常规细菌培养法检出阳性33例，阴性35例，阳性率48.53%；荧光PCR法检出阳性49例，阴性19例，阳性率72.06%。荧光PCR法检出肺炎克雷伯菌的阳性率高于常规细菌培养法。未发现细菌培养阳性而荧光PCR法扩增阴性标本。见表1。

表1 两种方法对68例痰标本检测肺炎克雷伯菌阳性率比较

经统计学方法处理，χ2=3.93＞3.84=χ20.05(1)，P＜0.05，阳性检出率的差异具有统计学意义。

2.2 特异性试验培养为肺炎克雷伯菌的痰标本进行DNA提取后，PCR方法检测得7.06× 106copies/ml；而非肺炎克雷伯菌的痰标本结果为低于检测下限(＜500copies/ml)。表明荧光PCR法具有良好的特异性。

2.3 敏感性试验分别选取浓度为106copies/ml、105copies/ml、104copies/ml、103copies/ml、102copies/ ml、101copies/ml的标本进行DNA检测，结果最低可检出1×103copies/ml，与试剂说明书中产品性能指标的最低检测限：1×103copies/ml相符。

3 讨论

目前，肺炎克雷伯菌是重要的条件致病菌和医院感染病原菌之一，多见于年老体弱或原有慢性支气管-肺疾患者，亦可通过机械呼吸器、雾化器或各种导管而感染，笔者采用细菌培养法和荧光PCR法对肺炎克雷伯菌进行检测对比分析。结果表明，PCR检测的阳性率高于常规细菌培养法，且经统计学分析，两法有差异，具有统计学意义。同时结果表明荧光PCR法具有很高敏感性和特异性，与有关报道相符[6]。

培养法一直被认为是检测细菌最可靠的方法，但该方法操作复杂、技术要求严格、费时；而细菌荧光定量PCR检测技术具有很高的敏感性和特异性，不受细菌存活与否的限制，近年来广泛应用临床标本检测,但该方法对实验条件和检查技术要求较高，又因敏感性较高，容易受外界污染的影响而产生假阳性[7]。本实验中49例PCR阳性结果的标本，笔者认为不排除存在假阳性的可能。但未发现细菌培养阳性而荧光PCR法扩增阴性标本。然而，PCR检测的阳性率明显高于常规细菌培养法，分析原因可能还有：(1)采集标本细菌量少，加之杂菌生长迅速所覆盖；(2)患者采样前已使用过抗菌药物，抗菌药物抑制了细菌生长，导致培养结果阴性[5]。

肺炎克雷伯菌培养法一直是诊断克雷伯菌性肺炎的最可靠的方法，仍是目前主要的检测手段。但细菌培养所需时间较长，对疾病的的诊断有一定的滞后。荧光PCR法核酸检测具有不受病程影响、快速、敏感性和特异性高的优点[8，9]，作为一项常规实验室检查发出报告只需要4h[10]，可以及时为临床提供病原学的诊断结果。虽然PCR能较早检出病原菌，但不能进行抗菌药物的体外敏感试验，其在临床的应用还是受到一定的限制。加上PCR法要求在合格的PCR室进行，具有一定的局限性。但荧光PCR法是目前临床上检测克雷伯菌性肺炎的最佳方法之一，有条件的医院可以开展。

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Comparison between bacterium culture and real-time PCR in detection of Klebsiella pneumoniae

YANG Jian,LIU Jianrong HUANG Yongjian.Department of Clinical Laboratory,Pingxiang People’s Hospital,Pingxiang Jiangxi 337005,China

Objective To compare the correlation of bacterium culture and real-time PCR for Klebsiella pneumoniae detection.Methods A total of 68 suspected-infection sputum samples were taken and analyzed by both bacterium culture and realtime PCR to detect Klebsiella pneumoniae.The sensitivity and specificity of real-time PCR were also analyzed.Results The detection rate of Klebsiella pneumoniae by real-time PCR was significantly higher than that by bacterium culture[72.06%(49/68)vs. 48.53%(33/68),P＜0.05].The sensitivity of real-time PCR was 1×103copies/ml and there were no cross reactions with Klebsiella pneumoniae.Conclusion The positive rate of real-time PCR was higher than bacterium culture.The high sensitivity and specificity and the rapid turnaround time make real-time PCR valuable for effective clinical diagnosis.

Klebsiella pneumoniae;Bacterium culture;Real-time PCR

R446.5,R446.62,R378.99+6

A

1674-1129(2014)06-0692-02DOI∶10.3969/j.issn.1674-1129.2014.06.015

2014-08-25；

2014-09-17)

杨剑，女，1983年6月出生，学士学位，主管技师，研究方向为临床免疫学和分子生物学检验。