正交试验优选马尾松松针中总黄酮的闪式提取工艺

陈良胜

（河南省新县人民医院药剂科，新县465550）

正交试验优选马尾松松针中总黄酮的闪式提取工艺

陈良胜

（河南省新县人民医院药剂科，新县465550）

目的研究马尾松中黄酮的闪式提取工艺并与黄酮乙醇回流法对照差别。方法以马尾松提取液中黄酮的含量为指标，采用正交实验设计，对马尾松闪式提取法的影响因素分别进行考察，并在提取率、提取时间、溶剂用量等方面与文献报道的乙醇回流法进行比较。结果闪式提取的最佳工艺是85%乙醇，料液比1∶12，提取时间3.0min；闪式提取黄酮的含量经UV测定高于乙醇回流提取法。结论闪式提取法操作简便、高效节能、经济方便省时、提取率高。

闪式提取；马尾松；黄酮；正交试验

马尾松(Pinus massoniana)隶属裸子植物门松属植物，为常绿乔木，广布于我国长江两岸及其以南的广大地区。垂直分布在长江下游为海拔700米以下，长江中游为1100～1200米以下，西部为1500～2000米以下广大地区。近几年我国有专家为心脑血管病患者提供了一种全新的保健选择：用松针煮茶喝。松针的提取物富含天然水溶性生物黄酮浓缩物，是一种强抗氧化剂，能有效清除自由基。松针的主要活性物质为黄酮类、木脂素及其苷类。黄酮类化合物主要有槲皮素、双氢槲皮素、山柰酚等；木脂素主要有异落叶松脂素等；木脂素苷主要有木脂素的糖苷，还有莽草酸、对羟基苯基-2-丁酮、香草酸、氢醌等物质[1-3]。我国药典古籍中也有松针保健治病功效的诸多记载，李时珍的《本草纲目》中说松针“可入药、疗疾”，《神农本草经》中，将有助长寿的松针列为“上药”。现在，在美国、法国、西班牙等国，松针及松树的药用更为广泛[2-7]。因而提取分离松针中有效成分黄酮并加以开发应用，有着积极的意义。本文采取正交设计的办法考察溶剂、时间、料液比等对松针黄酮提取影响，得出其最佳工艺参数[4-7]。

1 材料与方法

1.1 试验材料UV760CRT双光束紫外可见分光光度计（日本岛津）；松针采自长江三峡库区铁峰山；芸香苷标准品（中国生物制品检验所.）；所用试剂均为分析纯。

1.2 方法松针叶中黄酮类物质含量的测定方法：黄酮类物质提取和测定具体方法如下[1]：

1.3 标准回归方程的建立精密称取芸香苷一定量，以60%乙醇溶解并稀释成每毫升60μg的浓度。精密量取0.5～5.0ml不同量溶液，分别用60%乙醇稀释至5ml，准确加入3ml 0.1mol.L-1AlCl3溶液和5ml 1mol.L-1醋酸钾溶液，放置20分钟，在UV760CRT双光束紫外可见分光光度计415nm处测定吸收度并建立标准回归方程为Y=-1.77+97.48X(r=0.9897)。

1.4 测定方法精密称取经烘至恒重松针粉（60目）0.5g于100ml的三角瓶中加入5ml 60%乙醇，将三角瓶和内容物一起称重（称至0.1g），然后在90℃水浴中回流1小时，冷却后再称重，并补充溶剂至原重，经滤纸过滤后，取2.5ml滤液至试管中，并加入2.5ml蒸馏水稀释至5ml精确加入3ml 0.1mol.L-1AlCl3和5ml mol. L-1醋酸钾溶液，放置20分钟，在UV760CRT双光束紫外可见分光光度计415nm处测定吸收度，以同一滤液同样量加水至13ml为对照，根据标准方程计算出黄酮含量。

表1 不同浓度芸香苷溶液的吸收度

2 黄酮的提取分离

2.1 闪式提取法正交实验本研究选取影响闪式提取工艺的三个因素，即乙醇浓度（A），料液比（B），提取时间（C）为考察因素，每个因素设计三个水平，选取L9（34）进行实验，取松针药材粗粉50g，根据因素水平表L9（34），进行闪式提取，过滤，滤液定溶至1000mL量瓶中，进行含量测定。实验安排及结果见表1。

表2 因素水平表

表3 正交设计表及结果（mg/g）

由上表可知A2B2C3为闪式提取最佳工艺。

2.2 方差分析将实验数据代入SPASS软件中，进行方差分析，见表2。结果表明：A因素具有显著差异，A2＞A3＞A1，故选择A2；B因素B2＞B3＞B1，故选择B2；C因素C3＞C2＞C1，BC因素均无显著性差异，根据表2中含量测定的结果显示，采用A3B2C3工艺条件，黄酮的含量最高，故定为最优工艺，即以12倍量75%乙醇，闪式提取3.0min。见表5，表6。

表4提取因素对提取率影响表

表5 方差分析表

2.3 验证实验为验证优选工艺的可靠性和重现性，取松针粉150g，按最优工艺进行闪式提取，平行实验5份，黄酮含量分别为3.42，3.86，4.01(mg/g)，表明该工艺稳定可行，可操作性和重复性强。见表3。

2.4 乙醇回流提取法松针粉一般采取采取加热回流法提取黄酮，参照相关文献方法提取松针黄酮。制备6批样品，并按照前述“松针黄酮的含量测定”方法测定，计算平均结果与闪式提取的优化结果进行对比，见表4。

表6 闪式提取与加热回流提取的比较

从表4得出，闪式提取法与乙醇加热回流提取法相比，闪式提取乙醇浓度基本相同，提取时间仅为后者的1/70，且闪式提取法黄酮含量较高。

3 结果与讨论

通过实验得到了松针黄酮闪式提取的最优工艺条件，即75%的乙醇，料液比1∶12，闪式提取时间3min。该方法具有提取时间短、提取效率高、操作简单、生产成本低等特点。与传统提取方法相比，闪式提取时间仅为后者的1/70，且闪式提取法总黄酮含量较传统方法为高。

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.Flora of China(中国植物志)[M].Beijing: Science Press，1978.36-40.

[2]Yamauchi S，Sugahara T，Nakashima Y，et al.Radical and superoxide scavenging activities of matairesinol and oxidized matairesinol[J].Biosci Biotechnol Biochem，2006，70:1934-1940.

[3]Kim YS，Shin DH.Volatile components and antibacterial effects of pine needle (Pinus densiflora S.and Z.)extracts[J].Food Microbiology，2005，22(1):37-45.

[4]Shen ZB，Theander O.Flavonoid glycosides from needles of Pinus Massoniana[J]. Phytochemistry，1985，24(1):155-158.

[5]Bi RF(毕跃峰)，Zheng XH(郑晓珂)，et al.Isolation and structure identification of lignan glycosides from pine needles of Pinus massoniana Lamb[J].Miq.Acta Pham Sin(药学学报)，2002，37(8)：626-629.

[6]Bi RF(毕跃峰)，Zheng XH(郑晓珂)，et al.Study on the chemical constituents of Masson Pine[J].Miq.Acta Pham Sin(药学学报)，2001，36(11)：832-835.

[7]Feng WS(冯卫生)，Wang YZH(王彦志)，Zheng XH(郑晓珂)，et al.Isolation and structure identification of the chemical constituents of the of Masson Pine[J]. Miq.Acta Pham Sin(药学学报)，2004，39(3)：190-193.

Multi-Stage Flash Distillation Extraction of Flavoneand from Pinus Massoniana

Chen Liangsheng
(Xincounty people's hospital of Henan province,Xinyang465550,China)

Objective To study the multi-stage flash distillation extraction of Flavoneand from Pinus massoniana,and compared ethanol refluxing extraction of Flavoneand from Pinus massoniana.Methods The content of Flavoneand in extract of Pinus massoniana was taken as index,and orthogonal design was applied to observe the influence factors on multi-stage flash distillation extraction．Multi-stage flash distillation extraction was compared with ethanol refluxing extraction reported in literature in extraction rate,extraction time and ethanol consumption as factors．Results The optimized technique of homogenate extraction was as follows：85%ethanol in 12 times volume，homogenate extraction for 3 minutes,The homogenate extraction is slightly higher than that of ethanol reflux extraction.Conclusion Homogenate extraction is simple,high efficiency and energy saving,economical,high extraction rate.

multi-stage flash distillation extraction;P.massoniana;flavoneand;orthogonal test

10.3969/j.issn.1672-2779.2014.24.088

1672-2779（2014）-24-0155-02

苏玲 本文校对：孙先元

2014-10-22）