胃癌中P53诱导相关微小RNA靶基因预测及生物信息学分析*

曹 辉，许 钟，白班俊，张玲玲

(贵州省人民医院:1.肿瘤科;2.消化内科，贵阳 550002)

微小RNA (miRNA)通过使其靶mRNA的降解或翻译抑制，在转录后水平调控基因表达[1]，参与调控细胞的增殖、分化及肿瘤发生、发展等生理和病理过程，因而受到广泛关注。多项研究对胃癌临床标本检测发现，相对于癌旁组织，胃癌中出现多种miRNA表达的异常上调或下调；同时，miRNA的表达也受到多种转录因子的调控，如P53可诱导miR-34a、miR-26b、miR-92、miR-29a、miR-25、miR-103、miR-128a等一系列miRNA的表达上调[2]。对野生型P53胃癌来说，探讨P53通过miRNA间接作用参与肿瘤的发生有助于深入理解该类肿瘤的发生机制。本研究拟通过生物信息学预测胃癌中P53诱导相关miRNA的靶基因，并进一步对其靶基因进行功能富集分析和信号转导通路富集分析，为后续的表达调控实验奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1目标miRNA的筛选 通过在线人类疾病相关microRNA数据库mir2disease[3]，检索胃癌中高表达的miRNA；用检索结果与P53诱导相关miRNA对比，取交集得到胃癌中P53诱导相关miRNA。

1.2靶基因的预测 确定目标miRNA后，利用在线预测软件miRNA 靶基因数据库miRGen(v3.0)进行靶基因预测(含PicTar、miRanda、DIANA-microT、TargetScanS 等miRNA 靶基因预测工具)[4]，得到目标miRNA的候选靶基因数据集。

1.3确立胃癌中的预测靶基因 通过在线基因表达谱数据库Gene Expression Atlas[5]检索获得胃癌中表达下调的基因，用预测的候选靶基因数据集与之比对，获得胃癌中目标miRNA的靶基因数据集。

1.4功能富集分析 通过在线软件DAVID[6]对预测的靶基因数据集进行功能富集分析；Pathway Miner进行信号转导通路分析。

2 结 果

2.1目标miRNA的筛选情况 应用在线mir2disease数据库检索胃癌相关miRNA，根据其详细注释筛选出在胃癌中表达上调的基因，共18个；汇总胃癌中高表达的miRNA与P53诱导相关miRNA[2]两者对比，初步获得本研究候选miRNAs，见图1。

图1 目标miRNA筛选图

2.2miR-21靶基因的预测 从候选目标miRNA中选择文献报道较多的miR-21，通过在线软件预测其靶基因，用集成常用预测工具的miRGen(v3)分析，结果共获得1 090个基因。

2.3确立胃癌中的预测靶基因 应用在线基因表达谱数据库Gene Expression Atlas检索，选择 “(All genes) and down in gastric carcinoma”，限定为“Homo sapiens”，获得胃癌中表达下调的基因共2 737个，用预测的1 090个候选靶基因数据集与之比对，获得胃癌中目标miRNA的靶基因数据集共115个，见表1。

2.4功能富集分析结果 应用DAVID进行Gene_Ontology分析时，选择系统默认的GOTERM_BP_FAT、GOTERM_CC_FAT、GOTERM_MF_FAT 3个库，其中P<0.01部分结果见表2。通过Pathway Miner分析相关信号通路(表3)，细胞调节通路包括黏附连接、脂肪细胞因子信号转导通路、胰岛素信号转导通路、细胞凋亡、钙信号转导通路、JAK-STAT信号转导途径等，代谢途径包括赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、丁酸代谢、脂肪酸代谢、丙酮酸代谢等，见图2。

表1 胃癌中miR-21的靶基因预测与筛选结果

-：此项无数据。

表2 应用DAVID进行Gene_Ontology功能富集分析(部分)

续表2 应用DAVID进行Gene_Ontology功能富集分析(部分)

表3 Pathway Miner分析中KEGG部分相关信号通路名称

图2 Pathway Miner分析中部分信号通路涉及基因(KEGG)

3 讨 论

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，在胃黏膜癌变过程中，P53等多种抑癌基因的变化参与了胃癌形成。P53和多种转录因子之间存在着相互作用，但仍难以充分阐明胃癌发生机制。近年来发现P53可影响一组miRNA的表达[2]，为本研究提供了新的契机。

miRNA作为一类具有调控基因表达的非编码RNA(约18～22 nt)，通过使其靶mRNA的降解或翻译抑制，在转录后水平调控基因表达[1,7]。miRNA通过这种机制参与调控细胞的增殖、分化及肿瘤发生、发展等生理、病理过程。同时，miRNA的表达也受到多种转录因子的调控，P53可诱导一系列miRNA的表达上调[2]。通过对胃癌临床标本的检测，发现相对于癌旁组织，胃癌中出现多种miRNA表达的异常表达，如mir-34、mir-128a、miR-92、miR-25、miR-103等的上调，mir-128b、mir-129、mir-148等的下调[8-10]。正是由于miRNA与转录因子之间存在相互调控作用，推测在野生型P53胃癌中，P53可能在诱导miRNA的表达后，进而通过miRNA对下游基因的转录后水平调控，从而促进肿瘤的发生。因此，作者进行了相关生物信息学分析，为后续研究提供理论基础。

通过在线数据的深度挖掘，成功缩小胃癌中目标miRNA分析范围。miR-21与胃癌的发生和转移有关，有望作为胃癌分子标志[11]，选择其进一步分析预测靶基因。经过整合常用miR靶基因预测软件的靶基因数据库miRGen(v3)进行靶基因预测后，应用基因表达谱数据库有效缩小靶基因范围，获得在胃癌中相关的预测靶基因集。应用在线软件DAVID和Pathway Miner分别进行GO基因注释、功能富集分析和信号通路分析。结果显示在胃癌中MiR-21的靶基因涉及系列信号通路中，包括黏附连接、胰岛素信号转导通路、细胞凋亡、钙信号转导通路、JAK-STAT信号转导途径等与肿瘤发生、发展及转移密切相关的信号通路[12-13]。

经过充分数据发掘，利用生物信息学分析结果所提供的重点信号转导通路为基础，可以开展针对性的实验研究，将有助于进一步理解P53、miRNA及下游靶基因组成的调控网络在胃癌发生、发展中的作用机制。

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