烟草重要基因篇：1. 烟草抗病相关基因

龚达平



烟草重要基因篇：1. 烟草抗病相关基因

龚达平

（中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101）

烟草是重要的经济作物之一，也是研究植物与病害互作的主要模式生物。烟草病害种类泛多，对烟草危害较为严重的病害有黑胫病、赤星病、青枯病、烟草普通花叶病、黄瓜花叶病、马铃薯Y病毒等。化学药剂防治会引起环境污染、农药残留、烟叶安全性等问题，而培育烟草抗病新品种是解决这些问题的根本途径。烟草抗病相关基因或分子标记的获得可高效靶向加快培育烟草抗病新品种的步伐。

1 抗黑胫病相关基因

烟草黑胫病由真菌（）引起。张锦伟等[1]以高抗黑胫病的烟草品种K326苗期接种黑胫病菌丝3天后取叶片构建了cDNA文库。苏振刚等[2]以烟草黑胫病抗性品种革新3号为材料，利用黑胫病0号生理小种诱导构建抑制差减（SSH）文库，筛选出57个对烟草黑胫病抗性相关的差异表达基因。肖炳光[3]利用感黑胫病品种红花大金元和抗黑胫病种质RBST构建BC1（红花大金元/RBST//红花大金元）群体，将抗黑胫病基因Ph精确定位在标记TM10401和PT52634间的0.191 cM范围内。肖炳光等[4]（2013）利用抗黑胫病雪茄品种Florida 301和感黑胫病品种Hicks的重组自交系群体，鉴定了11个QTL，其中贡献最大的一个QTL解释了16.9%的大田表型变异和18.6%的温室表型变异。Vontimitta等[5]（2012）利用Beinhart 1000和Hicks构建的DH群体，鉴定了6个QTL，其中位于4号和8号染色体的两个位点分别解释了25.4%和20.4%的表型变异。

2 抗赤星病相关基因

烟草赤星病由赤星病菌（）引起。童治军等[6]（2012）以感赤星病品种长脖黄和抗赤星病品种净叶黄构建F2群体，利用SSR标记在3个连锁群上检测到3个与赤星病抗性相关的QTL，抗性等位基因均来自净叶黄。这3个QTL解释了双亲病情指数差值的86%左右，其中约61%为加性效应。蒋彩虹等[7]（2013）以抗烟草赤星病品种净叶黄与感病品种NC82构建F2代分离群体，获得了一个抗赤星病基因的SSR标记连锁群M，该连锁群包括12个标记，全长181.5 cM，平均间距15.1 cM，抗性基因被定位在标记J4与J9之间，其中与J9的遗传距离仅为4 cM。

3 抗青枯病相关基因

烟草青枯病是一种由青枯菌（）引起的细菌性病害。杨柳[8]（2012）以中抗青枯病品种岩烟97和感病品种红花大金元杂交得到的237个F2:3家系为作图群体，利用SSR标记检测到2个主效QTL，分别位于第17a、17b连锁群上，分别解释了25.7%和13.28%的表型变异。在联合分析时，检出2对具有上位效应的QTL，贡献率分别为4.73%和3.91%。Qian Y L等[9]（2013）利用Enshu×TI448A和Yanyan97×TI448A的F2群体，鉴定了位于连锁群3和5上的4个QTL位点（qBWR-3a，qBWR-3b，qBWR-5a和qBWR-5b）；这4个位点分别解释了9.00、19.70、17.30和17.40%的表型变异。

4 抗烟草普通花叶病毒相关基因

烟草普通花叶病毒病在我国各产烟区均有分布，病原为烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）。烟草N基因是理想的抗TMV基因，它和TMV之间的互作是植物和病毒互作领域的经典系统。N基因起源于粘毛烟草（），是Whitham等[10]（1994）和Dinesh-Kumar等[11]（1995）利用转座子标签法进行分离的，其结构、功能及表达特点都得到了深入研究。N基因编码一个131.4 kDa的蛋白质，属于典型的TIR-NBS-LRR抗病基因。Padgett等[12]（1993）报道，TMV复制酶126/183 Kda蛋白是激发N基因介导的过敏反应（HR）所必须的；后来Erickson等[13]（1999）用农杆菌介导的表达策略证明，50 kDa TMV解旋酶片段（p50）足以引发N基因介导的HR。Dinesh-Kumar等[14]（2000）证实，N基因的5个外显子经选择性剪切可编码NS和NL两个转录物；在TMV侵染后3 h之内以NS为主；4~8 h以NL为主。烟草N基因介导的TMV抗性是识别病原经系列信号传导产生防卫反应。N基因介导的HR是第一个防卫反应，可限制TMV于枯斑及其邻近部位；HR随后诱导整个植株非特异的普遍的防卫反应即系统获得性抗性（SAR）。

5 抗黄瓜花叶病毒相关基因

烟草黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus, CMV）是世界上分布最广的植物病毒之一，其株系繁多，每年都给烟叶生产造成重大的经济损失。文轲等[15]（2013）以感CMV品种NC82和抗CMV品种台烟8号及其F1为材料，从2317对SSR引物中筛选出127对多态性引物。进一步挑选62对SSR引物，对经过CMV接种鉴定的288个BC1（NC82/台烟8号//NC82）单株进行标记定位分析。采用复合区间作图法进行QTL定位，检测到一个QTL位于10号连锁群上，在标记53735与54196之间，标记53735与抗性紧密连锁，遗传距离为0.1 cM，贡献率为13%，暂命名为qCMV-1，其抗性等位基因来自台烟8号。

6 抗马铃薯Y病毒相关基因

烟草马铃薯Y病毒病（potato virus Y，PVY）是烟区的主要病毒病害。陈帅等[16-17]（2010）和周佳等[18]（2010）以不同PVY诱导时期的白肋烟品种VAM叶片mRNA作为探针，利用cDNA芯片筛选已构建的抑制差减杂交文库，共有915个克隆为表达上调（Ratio＞2）；对上调表达明显的天冬氨酸蛋白酶基因Ntasp、NtERD1和NtPsaN进行了全长克隆和表达分析，它们受到PVY的显著诱导。Julio等[19]（2013）利用Illumina测序技术，对12个F7重组自交系进行转录组测序，获得了在感病材料中高表达，而在抗病材料中不表达的真核细胞翻译起始因子4E（eIF4E）。进一步对100个F8重组自交系的PCR实验验证了感病性与eIF4E表达的相关性；利用F2分离群体进行标记定位也证实了eIF4E基因突变与PVY抗性完全连锁；通过筛选EMS诱导的突变群体，获得了两个eIF4E基因提前终止的抗PVY突变体。

7 问题与展望

抗TMV的N基因和抗PVY的eIF4E基因均是单基因，很容易进入烟草的育种程序，但其他主要病害还需要进一步进行QTL的精细定位。随着烟草基因组测序的完成和功能基因组的开展，将加快对烟草抗病基因的深入研究，如据王元英[20]（2011）分析，烟草基因组中包含400多个NBS-LRR类抗病基因。分子育种必将成为今后烟草抗病育种的主要手段。

[1] 张锦伟，李文正，谭学林. 抗黑胫病烟草品种K326 cDNA文库的构建[J]. 云南农业大学学报：自然科学版，2005，20（6）：766-770.

[2] 苏振刚，杨爱国，孙玉合，等. 黑胫病菌诱导的烟草SSH文库构建及其分析[J]. 作物学报，2011，37（10）：1763-1770.

[3] 肖炳光. 烟草分子标记遗传连锁图构建和重要抗病基因定位[J]. 中国烟草科学，2013，34（3）：118-119.

[4] Xiao B G, Drake K, Vontimitta V, et al. Location of genomic regions contributing to Phytophthora nicotianae resistance in tobacco cultivar Florida 301[J]. Crop Sci, 2013, 53(2): 473-481.

[5] Vontimitta V, Lewis R S. Mapping of quantitative trait loci affecting resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart-1000[J]. Mol Breeding, 2012, 29: 89-98.

[6] Tong Z, Jiao T, Wang F, et al. Mapping of quantitative trait loci conferring resistance to brown spot in flue-cured tobacco (Nicotiana tabacum L.)[J]. Plant Breeding, 2012, 131(3): 335-339.

[7] 蒋彩虹，王元英，任民，等. 一个抗赤星病基因的SSR标记连锁群[J]. 分子植物育种，2013，11（4）：566-569.

[8] 杨柳. 烟草SSR连锁图谱构建及青枯病抗性QTL定位[D]. 福州：福建农林大学，2012.

[9] Qian Y L, Wang X S, Wang D Z, et al. The detection of QTLs controlling bacterial wilt resistance in tobacco (N. tabacum L.)[J]. Euphytica, 2013, 192( 2): 259-266.

[10] Whitham S, Dinesh-Kumar S P, Choi D, et al. The product of the tobacco mosaic virus resistance gene N: similarity to toll and the interleukin-1 receptor[J]. Cell, 1994, 78: 1101-1115.

[11] Dinesh-Kumar S P, Whitham S, Choi D, et al. Transposon tagging of tobacco mosaic virus resistance gene N: its possible role in the TMV-N-mediated signal transduction pathway[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92: 4175-4180.

[12] Padgett H S, Beachy R N. Analysis of a tobacco mosaic virus strain capable of overcoming N gene-mediated resistance[J]. Plant Cell, 1993, 5: 577-586.

[13] Erickson F L, Holzberg S, Calderon-Urrea A, et al. The helicase domain of the TMV replicase proteins induces the N-mediated defence response in tobacco[J]. Plant J, 1999, 18: 67-75.

[14] Dinesh-Kumar S P, Baker B J, Alternatively spliced N resistance gene transcripts: Their possible role in tobacco mosaic virus resistance[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97: 1908-1913.

[15] 文轲，张志明，任民，等. 烤烟CMV抗性的QTL定位[J]. 中国烟草科学，2013，34（3）：55-59.

[16] 陈帅，刘贯山，周佳，等. 受PVY诱导的烟草天冬氨酸蛋白酶基因Ntasp的克隆与分析[J]. 中国农业科学，2010，43（16）：3331-3339.

[17] 陈帅，刘贯山，杨爱国，等. 受PVY诱导的烟草NtERD1的基因分离与表达分析[J]. 中国烟草科学，2010，31（5）：62-67.

[18] 周佳，李凤霞，陈帅，等. 烟草抗马铃薯Y病毒病相关基因NtPsaN的克隆及表达分析[J]. 中国农业科学，2010，43（16）：3323-3330.

[19] Julio E, Cotucheau J, Decorps C, et al. Characterization of PVY (Potato Virus Y) resistance in tobacco: potential role of an eIF4E gene identified by high throughput sequencing technologies[C]//The 10th Solanaceae Conference, 2013.

[20] 王元英. 烟草抗病基因筛选及其高通量RNAi载体库的构建[D]. 北京：中国农业科学院研究生院，2011.