低分子凝胶M2和交联透明质酸作为可注射性软骨再生支架的可行性研究

殷宗琦 李 萍 李 丹 刘浥 汪振星 刘 豫 冯传良 周广东

低分子凝胶M2和交联透明质酸作为可注射性软骨再生支架的可行性研究

殷宗琦 李 萍 李 丹 刘浥 汪振星 刘 豫 冯传良 周广东

目的探讨以低分子量凝胶M2和交联透明质酸（Hyaluronic acid，HA）作为可注射性支架材料，在裸鼠体内构建组织工程软骨的可行性。方法常规分离、体外单层培养新生猪耳软骨细胞，将获得的软骨细胞以50×106cells/mL和100×106cells/mL的浓度分别与M2凝胶混合，以100×106cells/mL的浓度与交联HA混合，分别注射于裸鼠皮下，并于8周后取材。以单纯M2凝胶及单纯HA作为对照组。通过大体观察、组织化学检查、湿重测定、力学检测、蛋白聚糖（Glycosaminoglycan，GAG）含量测定，判断低分子量凝胶M2及交联透明质酸在体内形成软骨的能力。结果实验组3组均可形成软骨样组织块。其中，M2+高浓度细胞组体积最大、质地较硬、表面光滑，软骨细胞位于成熟的陷窝中；M2+低浓度细胞组形成与高浓度细胞组质地相似的组织块，但体积相对较小；HA组形成不成熟的组织块，硬度差，含有的细胞数和分泌的基质最少。同时，实验组3组的力学和GAG含量结果也证实M2+高浓度细胞形成的软骨更加成熟。各组间具有显著性差异。2个对照组未有类软骨组织形成。结论低分子凝胶M2与软骨细胞的生物相容性优于交联HA，更适合作为可注射性支架材料用于组织工程化软骨的构建。

低分子凝胶交联透明质酸可注射支架材料组织工程化软骨

软骨损伤的修复是临床治疗的难题，组织工程为软骨修复提供了新的可能，其中支架材料是关键问题之一。近年来，微创手术发展迅速，可注射性支架材料将成为与之匹配的理想选择。可注射软骨是指通过组织工程学方法，使细胞与可注射的支架材料混合，形成细胞-材料复合物后，将其注射到体内特定部位形成软骨组织，达到修复软骨缺损或局部填充美容塑形的目的。可注射软骨将具备操作简单、微创或无创，较易填补不规则缺损等优点，因而成为软骨组织工程的研究热点之一[1]。

目前，用于可注射软骨研究的材料主要为凝胶类，如胶原、纤维蛋白、透明质酸（Hyaluronic acid，HA）、海藻酸盐、琼脂糖[2-3]和氧化聚乙烯[4]等。其中，HA是最常用的可注射性支架材料之一[5-7]，但存在降解过快、力学性能较差等问题。通过交联的方法可以提高HA的力学强度，延缓其降解速度，但交联后是否仍然适合作为可注射性软骨再生支架，目前尚无系统的研究报道。因此，本研究以新生猪耳软骨细胞为种子细胞，分别与交联HA及低分子水凝胶M2（我们与上海交通大学材料科学与工程学院合作研发）混合，比较这两种材料在体内构建组织工程软骨的效果，以探讨其作为构建可注射性软骨再生支架的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物

软骨细胞取自1周龄贵州香猪（上海甲干生物科技有限公司）。实验使用BALB/c裸鼠，共15只，6～8周，雄性，由上海实验动物资源中心（西普尔-必凯公司）提供。

1.2 实验试剂和仪器

高糖DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素-两性霉素B、胰蛋白酶（Hyclone公司，美国）；NB4胶原酶（Sigma公司，美国）；细胞计数试剂盒（CCK-8，东仁化学科技有限公司，上海）；低分子量凝胶M2粉剂（上海交通大学材料科学与工程学院，上海）；交联HA（组织工程国家工程研究中心，上海）。

1.3 软骨细胞的分离培养及扩增

1.3.1 新生猪原代耳软骨细胞获取和培养

常规方法获取猪耳软骨细胞[8]，以1×104cells/cm2的密度接种于100 mm培养皿内，置于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每3天换液一次。原代软骨细胞生长达到70%～80%融合后，以0.25%的胰蛋白酶消化传代，按上述条件继续培养及传代。

1.3.2 细胞生长曲线

[9]的方法，用细胞计数试剂盒测量第1代到第3代细胞在第1、3、5、7、9天的OD值绘制成细胞生长曲线。

1.4 支架材料制备及生物学性状观察

分别制备与体内注射等量的支架材料：用1 mL二甲基亚砜（DMSO）溶解150 mg M2粉剂，制成M2溶液，取40 μL M2溶液与960 μL生理盐水混匀，形成M2低分子量凝胶。将M2凝胶与交联HA分别置于小玻璃瓶中，观察其生物学性状。

1.5 组织工程软骨构建

取第3代的软骨细胞，离心弃上清液后，分为3个实验组和2个支架对照组，分别在裸鼠体内构建组织工程软骨。实验组：①M2凝胶混合高浓度细胞组（M2+100），将细胞与M2凝胶混匀，使细胞在凝胶中的终浓度为100×106cells/mL；②M2凝胶混合低浓度细胞组（M2+50），细胞与M2凝胶混匀，使其在凝胶中的终浓度为50×106cells/mL；③交联HA混合高浓度细胞组（HA+100），将细胞与HA混匀，使细胞在HA中的终浓度为100×106cells/mL。上述3组均将凝胶细胞混合物注射于裸鼠脊柱两侧腹部皮下，每点注射0.2 mL。支架对照组：①单纯M2凝胶组（M2）；②HA组。注射方法同实验组。各组均为3只裸鼠，共6个注射点。

1.6 大体观察和湿重测定

注射后8周取材，剥离表面的包膜，进行大体观察及湿重测量。

1.7 生物力学检测

用直径为5 mm的角膜环钻随机切取组织工程化软骨样本，均修剪成高度为1 mm的圆形标本，以最大负荷450 N，1 mm/min的位移速度加压，计算弹性模量。

1.8 蛋白聚糖（Glycosaminaglycan，GAG）含量测定

参照文献[10]的方法，采用Alcian Blue法检测再生软骨组织中的GAG含量。以硫酸软骨素标准品（Sigma公司，美国）绘制标准曲线，根据酶标仪比色结果（波长为600 nm）与标准曲线，计算GAG含量。

1.9 组织学检测

将标本固定于4%多聚甲醛24 h，脱水、石蜡包埋，切片（厚度为5 μm），进行苏木素-伊红染色及番红-O染色，观察组织结构及细胞外基质分泌情况。

1.10 统计学分析

体内再生组织湿重、生物力学性能、GAG含量等定量指标以x±s表示（n=6），统计采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。统计软件包为SPSS 12.0。

2 结果

2.1 支架材料生物学性状观察

近年来，扬州市食品药品监督管理局稽查处勇于担当，积极作为，成功查处了一批在全国有影响的大案要案，5次受到国家总局表彰，8次受到省局表彰，稽查工作在全国位居前列。央视《焦点访谈》先后2次进行专题报道，该处被群众赞誉为保障食品药品安全的“钢刀利剑”。

交联HA（图1A）和低分子量水凝胶M2（图1C）的原料均为白色粉末状。制备后的交联HA为无色透明的凝胶状（图1B），M2水凝胶为乳白色半透明团块（图1D）。

图1 材料大体观Fig.1 Gross view of materials

2.2 软骨细胞形态及生长曲线观察

原代软骨细胞接种后12～24 h贴壁，48 h后开始增殖、分化。软骨细胞刚贴壁时仍为圆形，逐渐伸展后呈三角形或多角形，细胞排列紧密，折光性强。传代后生长速度加快。不同代次的软骨细胞光镜下均呈现良好的形态特征（图2A-C），生长曲线结果表明不同代次的软骨细胞的扩增能力无明显差异（图2D）。

图2 不同代次软骨细胞形态学观察及生长曲线（40×）Fig.2 Morphological observation of chondrocytes in different passage and their growth curve(40×)

2.3 再生软骨组织检测

2.3.1 大体观察

3个实验组均可形成软骨样组织块，以M2+100组体积最大、质地较硬、表面光滑，有细腻光泽，呈瓷白色，有一定的硬度和弹性，组织致密，中央未出现空心现象（图3A、B）；M2+50组形成具有与高浓度细胞组相似质地的软骨组织块，但体积相对较小（图3E、F）；而HA+100组形成的软骨组织较不成熟且硬度较差，剖面观出现空心现象，含有部分未降解的HA和水分（图3I、J）。单纯M2凝胶注射组在体内已完全降解，无法取材。单纯交联HA注射组未完全降解，材料被结缔组织所包裹，未见类软骨样组织形成。

图3 体内再生软骨大体观和组织学观察Fig.3 Gross view and histological observation of regenerated cartilage in vivo

2.3.2 组织学检测

2.3.3 组织湿重、生物力学及GAG含量检测

M2+100、M2+50和HA+100三组的平均湿重分别为（179±9）mg、（146±11）mg、（170±10）mg；杨氏模量分别为（14.75±0.425）MPa、（12.89±0.374）MPa、（7.14±0.539）MPa；GAG含量分别为（38.03±2.743）mg/g、（33.29±3.536）mg/g、(12.24±1.386)mg/g。统计结果表明，M2+100组湿重和弹性模量显著高于M2+50组（P＜0.05），提示细胞接种密度对再生软骨的质和量均有重要影响。M2+100组和M2+50组杨氏模量、GAG含量均显著高于HA+100组（P＜0.05），提示M2组再生软骨的质量和力学性能均优于交联HA组，表明低分子凝胶M2较交联HA更适合作为可注射软骨再生支架。HA+100组能维持较大的组织湿重可能是由于组织内部形成的空洞结构中带有较多水分所致（图4）。

图4 各组湿重、杨氏模量和GAG含量Fig.4 Wet weight,Young's modulus and GAG content in each group

3 讨论

组织工程软骨研究和应用中，支架材料是重要的研究内容之一。优良的支架材料应具有良好的生物相容性、可降解性，组织细胞能较好地附着于材料支架并增殖分化形成功能性组织，材料在被降解吸收的同时可为新生组织所替代，并且适合于临床应用的实际需要。与特定形态的聚合物支架材料相比，可注射的生物材料与细胞均匀混合后,可注射到不规则的缺损区，创伤小，方法简单，安全有效，同时也符合现代美容整形领域对微创的要求，因此可注射型软骨成为软骨组织工程应用研究的重要发展方向。

目前,临床研究中最常用的可注射生物材料为透明质酸。透明质酸又名玻璃酸，是一种高分子非蛋白质酸性黏多糖。透明质酸易溶于水而形成黏弹性流体，但力学性能较差，降解速度较快。因此，在机械强度及稳定性要求较高部位的应用受到限制。通过1,4丁二醇二缩水甘油醚（1,4-Butanediol diglycidyl ether，BDDE）交联，可以显著提高HA的力学性能，延缓其降解速率，交联后的HA已广泛用于面部除皱和体表软组织缺损充填。但交联后的HA作为可注射性软骨再生支架的相关报道较少。本研究结果表明，交联HA组形成的软骨均质性、GAG含量和力学性能等均明显劣于低分子凝胶M2组，特别是再生组织出现了明显的空心现象。导致这一结果的可能原因包括：①交联HA作为高分子凝胶，流动性较差，细胞在接种时很难混合均匀，因此形成的软骨不均质；②注射到体内后，由于复合物外周营养充分，软骨形成较快，外周软骨形成后会导致中心营养渗透障碍，因而容易出现中央空心现象；③交联HA降解速率过慢，大量HA残留占据了物理空间，不利于软骨细胞外基质再生和重塑，影响了再生软骨的均质性和软骨基质含量。因此，我们认为交联HA并非理想的可注射性软骨再生支架，适当降低交联程度，改善其流动性及降解速率可能有助于提高其软骨再生效果。

本研究应用的M2材料属于低分子凝胶，是基于合成苯环结构结合天然氨基酸制备的复合材料，同时具备合成材料的可控性和天然材料优良的生物相容性。该材料分子可设计性强，灵活度高，可根据细胞种类的不同，而选择不同的制备性能以满足不同的需求。例如，可以在低分子凝胶体系加入海酸藻钠来进一步提高其力学特性，并通过调节其钙离子含量来调节强度以满足不同种类细胞及不同功能应用的需要。另外，低分子量凝胶结构内部空间较大，降解速率适中，便于在软骨再生过程中为营养物质、生长因子及其他可溶性分子的扩散提供足够的空间，从而较好地维持细胞的活性，利于细胞的生长增殖和组织再生。本实验结果证明，M2加高浓度细胞组的标本体积最大、质地较硬、表面光滑，软骨细胞位于成熟的陷窝中；M2加低浓度细胞组形成与高浓度细胞组质地相同的组织块，但体积相对较小。这说明与HA相比，M2材料运用于软骨构建时，所形成的组织工程软骨质量较好，同时在力学强度等方面也具有更大的优越性。M2作为可注射性材料，在构建组织工程软骨方面具有很大的应用潜力。

但是，本实验仅在裸鼠体内对该凝胶成软骨的能力进行了分析，没有深入地对材料的生物安全性进行检测。在后续的实验中，我们将对该材料进行深入的研究，并建立大动物模型。

4 结论

交联HA与软骨细胞复合形成的软骨不均质，力学性能差，不是理想的可注射型软骨再生支架；低分子量凝胶M2与软骨细胞复合，可形成均质成熟的软骨组织，再生软骨具有较高的软骨基质含量和力学性能，是较为理想的新型可注射型软骨再生支架。

参考文献

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Low-Molecule-Weight Hydrogel M2 and Cross-Lincked Hyaluronic Acid as Injectable Cartilage Regeneration Scaffolds

YIN Zongqi1,LI Ping2,LI Dan1,LIU Yi1,WANG Zhenxing1,LIU Yu1,FENG Chuanliang2,ZHOU Guangdong1.

1 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai 200011,China;National Tissue Engineering Center of China,Shanghai 200041,China;2 Shanghai Jiaotong University School of Materials Science and Engineering,Shanghai 200240,China.Corresponding author:Zhou Guangdong(E-mail:guangdongzhou@126.com).

ObjectiveTo explore the feasibility of low-molecule-weight hydrogel M2 and cross-lincked hyaluronic acid (HA)as injectable materials for cartilage tissue engineering in nude mice.MethodsThe auricular chondrocytes of newborn pig were isolated and expanded.The cells were mixed with M2 hydrogel in 50×106cells/mL and 100×106cells/mL,and were mixed with HA in 100×106cells/mL,followed by subcutaneous injection into nude mice.M2 hydrogel and HA were also injected as control groups.After 8 weeks,the samples were harvested and evaluated for cartilage formation by gross view, histochemical examination,wet weight test,mechanical analysis and glycosaminoglycan(GAG)quantification.Results All three groups formed cartilage-like tissues.Samples in M2 group with high cell density(100×106cells/mL)were the largest in size with stiffest texture,smoothest surface,and most abundant lacuna structures.Samples in M2 group with low cell density (50×106cells/mL)also formed cartilage-like tissue with stiff texture,but their size shrank obviously;HA group,however, formed immature cartilaginous tissue with poor rigidity,cellularization and cartilage specific matrix expression.Thecorresponding quantitative data further demonstrated that samples in M2 group with high cell density had the highest GAG content and strongest mechanical property.Statistically significant differences were observed among 3 groups.No cartilagelike tissue were formed in the 2 control groups.ConclusionLow-molecule-weight hydrogel M2 has better biocompatibility than hyaluronic acid,and M2 can be more suitable for TE cartilage construction.

Low-molecule-weight hydrogel;Cross-lincked hyaluronic acid;Injectable scaffold; Tissue engineering cartilage

Q813.1+2

A

1673－0364（2014）06－0305－05

2014年10月14日；

2014年11月5日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.06.002

国家高技术发展计划重大专项（863项目，2012AA020507）。

200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科，上海市组织工程研究重点实验室；200041上海市组织工程国家工程研究中心（殷宗琦，李丹，刘浥，汪振星，刘豫，周广东）；200240上海市上海交通大学材料科学与工程学院（李萍，冯传良）。

周广东（E-mail：guangdongzhou@126.com）。