以PECAM-1为标志去除残留未分化胚胎干细胞的研究

王玲唐 郑 雅 付 炜 张文杰

·论著·

以PECAM-1为标志去除残留未分化胚胎干细胞的研究

王玲唐 郑 雅 付 炜 张文杰

目的以血小板内皮细胞黏附分子-1（Platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1）为标志，去除小鼠胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ESCs）中残留未分化的细胞，以去除其致瘤性，为ESCs在研究中的安全应用提供思路。方法将小鼠R1胚胎干细胞株在撤去白血病抑制因子的培养基中悬浮培养6 d，体外自发分化形成类胚体，消化打散后，以PECAM-1为标志进行磁珠分选，得到阳性与阴性细胞群体，分别以2×106个/点注射入裸鼠背部皮下，6～8周后观察畸胎瘤形成情况，组织学分析瘤体构成。结果裸鼠背部成瘤结果显示，PECAM-1+细胞群注射8个点中7个成瘤，成瘤率87.5%；而PECAM-1-细胞群注射8个点中1个成瘤，成瘤率12.5%。PECAM-1+细胞群与PECAM-1-细胞群成瘤率具有统计学差异（P=0.01）。结论应用PECAM-1可去除体外分化过程中的残留未分化ESCs，并去除其致瘤性。

胚胎干细胞残留血小板内皮细胞黏附分子-1

胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ESCs）具有自我更新和无限增殖能力，可分化为生物体所有的细胞类型，在细胞治疗和再生医学中具有广泛的应用前景，而致瘤性仍然是ESCs未来临床应用中面临的重大问题。研究证实，即使极少量的ESCs植入裸鼠体内也会导致畸胎瘤的产生，并且将ESCs体外分化后高纯度分选移植裸鼠体内，也不能避免畸胎瘤的产生[1-3]。有研究认为，畸胎瘤的形成是由于ESCs体外诱导分化过程中，残留有未分化的ESCs所致；ESCs分化残留的产生是细胞培养过程中染色体突变造成的[4]。我们的前期研究证实，ESCs体外分化残留是ESCs的固有特性[5]。许多研究都致力于去除残留未分化的胚胎干细胞，如引入自杀基因[6-8]、肿瘤抑制基因干扰[9-10]，利用细胞毒性抗体[11]或多能干细胞特异性表面标志物[12]。以阶段特异性胚胎抗原-5（Stage-specific embryonic antigen-5，SSEA-5）为标志物，利用流式细胞分选技术，可去除人胚胎干细胞中残留未分化的细胞，降低畸胎瘤形成率。SSEA-1是比较公认的小鼠未分化胚胎干细胞的表面标志物[1]，认为PECAM-1+/SSEA-1+细胞可能是残留未分化的胚胎干细胞[13]。我们在前期研究中，将畸胎瘤组织中SSEA-1阳性与阴性细胞分选后，给予胚胎干细胞培养条件培养后，发现SSEA-1阳性与阴性细胞均有克隆产生，提示SSEA-1可能并非理想的去除残留未分化细胞的标志。本研究以PECAM-1为标志，探讨应用PECAM-1去除残留未分化细胞的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠R1胚胎干细胞系由中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所赠送。

雄性BALB/c裸鼠16只，6周龄，体质量约20 g。动物购自中国科学院上海实验动物中心上海斯莱克实验动物有限责任公司；动物生产许可证号为SCXK（沪）2007-0005，使用许可证号为SYXK（沪）2007-0007。

高糖DMEM、15%FBS（Invitrogen公司，美国）；I MEM（Gibco公司，美国）；2 mmol/L L-谷氨酰胺、10 ng/mL丝裂霉素、50 μmol/L 1-硫代甘油（Sigma公司，美国）；10 ng/mL重组人LIF（Chemicon公司，美国）；生物素结合的大鼠抗小鼠CD31抗体、Streptavidin-PE/Cy5（BD Pharmingen公司，美国）；抗生物素MACS微珠、MASC（Miltenyi公司，德国）；FASC（Beckman公司，美国）。

1.2 ESCs培养和诱导分化

1.2.1 细胞培养

ESCs常规培养液为高糖DMEM、15%FBS、50 μmol/L MTG、2 mmol/L L-谷氨酰胺和10 ng/mL重组人LIF。10 ng/mL丝裂霉素处理后的MEFs作为滋养层细胞。

1.2.2 诱导分化

ESCs分化前，先在0.1%明胶上传1代；0.25%胰蛋白酶消化后，接种于培养皿，细胞浓度为（2～5）×104cells/mL。每个培养皿添加10 mL培养液。类胚体分化培养液为IMEM、15%FBS、50 μmol/L MTG、50 μg/mL抗坏血酸（Vit C）和2 mmol/L L-谷氨酰胺。培养液每3天半量换液。

1.3 磁珠分选和流式细胞仪纯度分析

1.3.1 磁珠分选

分离第6天类胚体中PECAM-1阳性细胞和阴性细胞群体。收获第6天类胚体细胞，消化为单细胞，以1×106cells/mL重悬于含0.5%胎牛血清的PBS中，加入抗生物素结合的大鼠抗小鼠CD31抗体（1∶200），克隆号为13.3，4℃孵育30 min。PBS漂洗3次后，以1.25×108cells/mL重悬于含加入0.5%胎牛血清的PBS中，加入抗生物素MACS微珠（1∶4），4℃孵育15 min，加入PBS，300 g漂洗10 min后，上机进行两次阴性选择，得到PECAM-1阳性细胞和阴性细胞群。

1.3.2 流式细胞仪分析

检测磁珠分选后PECAM-1阳性和阴性细胞群体纯度。取磁珠分选所得部分细胞，以1×106cells/mL重悬于含4%胎牛血清的PBS中，分别加抗生物素结合的大鼠抗小鼠CD31抗体（1∶200），克隆号为390，4℃孵育3 min。PBS漂洗3次后，加Streptavidin-PE/Cy5（1∶1 000），4℃暗处孵育30 min，PBS漂洗3次后，上机检测，结果用Flowjo软件分析。

1.4 畸胎瘤实验

检测磁珠分选所得两群细胞体内分化形成畸胎瘤的能力差异。将磁珠分选所得两群细胞分别悬浮在含10%血清的DMEM中，将2×106个细胞（0.2 mL）注射至BALB/c裸鼠侧背部皮下，左侧为PECAM-1+细胞群，右侧为PECAM-1-细胞群，左右各8个点位。6周后注射部位取材，观察瘤体形成情况。瘤体标本4%多聚甲醛固定、石蜡包埋切片、HE染色，光学显微镜观察瘤体组织构成。

1.5 统计学分析

使用SPSS 19.0软件进行统计学分析，采用卡方检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ESCs体外分化为EBs

正常传代培养的ESCs呈紧密的巢状克隆样生长，边缘光整（图1A）。将ESCs经0.25%胰蛋白酶消化打散后，以（2～5）×104cells/mL的细胞量接种于细菌培养皿，细胞在撤去LIF的培养基中呈悬浮生长，聚集成球，形成EBs（图1B）。球体边缘规整，透亮。

图1 R1-ESCs体外分化（标尺：100 μm）Fig.1 The differentiation of R1-ESCs cells (Scale bars:100 μm)

2.2 磁珠分选所得细胞纯度分析

第6天EBs中PECAM-1的表达量为25.6%左右（图2A）。为进一步明确经MACS分选的PECAM-1+和PECAM-1-细胞群的纯度，运用流式细胞分析仪分别对其进行检测。检测结果用Flowjo软件进行分析。分选得到的PECAM-1+细胞群中纯度约为63.6%（图2B），而PECAM-1-细胞群纯度约为94.4%，其中仍然含有5.6%PECAM-1+细胞（图2C）。

图2 PECAM-1+和PECAM-1-细胞纯度分析Fig.2 Purity of PECAM-1+cells and PECAM-1-cells

2.3 畸胎瘤形成及结果统计

为检测PECAM-1是否可作为理想的剔除致瘤细胞的标志，达到在ESCs分化环境中去除其致瘤性的目的，将分选得到的PECAM-1+和PECAM-1-细胞按相同细胞量2×106个/点分别注射入裸鼠背部皮下（图3A），6～8周后观察畸胎瘤形成情况（图3B）。将畸胎瘤形成情况进行统计，发现PECAM-1+细胞群注射8个点中7个成瘤，成瘤率87.5%；而PECAM-1-细胞群注射8个点中1个成瘤，成瘤率12.5%。PECAM-1+细胞群与PECAM-1-细胞群成瘤率具有统计学差异（P=0.01）。

图3 PECAM-1+和PECAM-1-细胞畸胎瘤形成实验Fig.3 The teratomas formation by PECAM-1+cells and PECAM-1-cells in vivo

2.4 畸胎瘤HE染色

注射后6～8周，PECAM-1+细胞与PECAM-1-细胞注射部位均有畸胎瘤形成，PECAM-1+细胞所形成畸胎瘤与PECAM-1-细胞所形成的畸胎瘤大小无明显差异（图4A）。HE染色显示，PECAM-1+细胞与PECAM-1-细胞所成畸胎瘤瘤体中，均存在成熟的内胚层、中胚层和外胚层组织（图4B、C）。

图4 PECAM-1-和PECAM-1+细胞形成畸胎瘤组织学分析Fig.4 Histological observation of teratomas formation by PECAM-1-cells and PECAM-1+cells

3 讨论

胚胎干细胞的致瘤性风险仍然是制约其临床应用的最核心问题。其致瘤的原因，有研究认为与胚胎干细胞体外分化过程中残留的未分化干细胞有关。如何有效去除残留的未分化细胞成为了研究的热点问题。通常采用两种方法：一种以目的细胞为焦点，选择目的细胞特异性标记阳性的细胞，去除其他类型细胞；一种以残留干细胞为靶点，选择干细胞特异性标记，去除残留干细胞，保留所有其他类型细胞。两者各有优缺点，前者目标细胞明确，但细胞类型单一，可能遗漏其他在移植中具有辅助功能的细胞；后者包含不同分化阶段的细胞，移植效果可能更好，但必须找到合适的分化残留细胞标记。

残留未分化细胞标志物的选择从已知的胚胎干细胞标志物着手，PECAM-1和SSEA-1是小鼠胚胎干细胞的标志。我们的前期研究发现，SSEA-1并不是合适的去除残留细胞的标志物（未发表数据）。因此，本研究着重探讨PECAM-1这一细胞表面标志。文献报道，PECAM-1不仅在成体组织的血管内皮细胞和造血系统的细胞上表达，同时也在鼠类胚胎干细胞的分化过程中及早期小鼠胚胎中表达，且未分化的胚胎干细胞也表达PECAM-1[13-19]。Yue等[13]对PECAM-1的表达量进行了基因水平和蛋白表达水平的研究，发现PECAM-1在ESCs中高表达，在体外分化早期1～2 d内表达迅速降低，5～6 d后逐渐回升，前期降低与ESCs分化有关，后期升高与血液和内皮细胞分化形成有关，在晚期20 d的EBs中依然有部分细胞共表达PECAM-1和SSEA-1，提示了这部分细胞很可能就是残留未分化的细胞。因此，我们选取了PECAM-1作为标志开展了本研究。

实验结果提示，致瘤细胞在PECAM-1+细胞群中富集，成瘤率高，但在PECAM-1-细胞群中也有个别畸胎瘤的产生，其原因很可能是由于细胞分选的纯度低而引起的。流式细胞仪分析结果显示，分选后的细胞中PECAM-1+细胞的纯度达60%以上，但即使混有40%左右的阴性细胞，也不会影响其形成畸胎瘤。而在PECAM-1-细胞群中，即使纯度达95%，但仍有5%左右的阳性细胞混在其中，这些混杂的细胞足以形成畸胎瘤。从阳性和阴性细胞的成瘤率统计分析可以看到两者有显著差异，提示了以PECAM-1为残留细胞标志物的可行性，但细胞分选技术有待提高。通常磁珠分选的纯度相对较低，如果要得到高纯度的细胞，流式细胞仪分选的效果更佳，但同时会面临分选时间长、对细胞损伤大等缺点。本实验明确了可以PECAM-1为残留细胞的标志，以此为标的的靶向性清除（包括分选、药物杀伤等）技术的开发，有望为解决分化残留细胞导致的致瘤性问题提供可行的方案。

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Removal of Ofteratoma-forming Cells from Differentiated Embryonic Stem Cells Based on PECAM-1 Expression

WANG Ling,TANG Zhengya,FU wei,ZHANG Wenjie.
Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering, Shanghai Stem Cell Institute,Shanghai 200011,China;National Tissue Engineering Center of China,Shanghai 200241, China.Corresponding author:ZHANG Wenjie(E-mail:wenjieboshi@aliyun.com).

ObjectiveTo prevent teratoma formation by removal of the residual undifferentiated cells from differentiated mouse embryonic stem cells(mESCs)based on PECAM-1 expression,to hopefully promote the safe use of ESCs-based treatment in future.MethodsMouse R1 ESCs were cultured in suspension to form embryoid bodies(EBs)in the absence of leukemia inhibitory factor for 6 days.EBs were then digested into single cells and sorted by magnetic activated cell sorting (MACS)based on PECAM-1 expression.Total of 2×106PECAM-1+and PECAM-1-cells were injected subcutaneously into nude mice respectively.Teratoma formation was measured after 6-8 weeks.ResultsSeven out of 8 injected points formed teratoma in the PECAM-1+cells after 8 weeks of injection,with a tumor formation rate of 87.5%.While only 1 out of 8 injected points formed teratoma in the PECAM-1-cells,with a tumor formation rate of 12.5%.A significantly difference was observed between PECAM-1 positive and negative cells(P=0.01).ConclusionPECAM-1 is a specific marker for residual cells,which could be utilized to remove residual undifferentiated ESCs from in vitro differentiated ESCs,and eventually solve the tumorigenicity problem of ESCs.

Embryonic stem cells;Residual;Platelet endothelial cell adhesion molecule-1

Q813.1+1

A

1673－0364（2014）06－0301－04

2014年9月2日；

2014年10月15日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.06.001

国家重点基础研究发展规划项目（“973”项目，2011CB964704）；国家自然科学基金（81271714，31170944）。

200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科，上海市组织工程研究重点实验室；200241上海市组织工程国家工程研究中心。

张文杰（E-mail：wenjieboshi@aliyun.com）。