TNF-α-308基因多态性与强迫症的易感性研究

高玉峰 ，邱海棠 ，王 帆，张向阳，傅一笑，罗庆华，杜 莲，邱 田，蒙华庆△

(1.广东省中山市第三人民医院二科 528451；2．重庆医科大学附属第一医院心理卫生中心 400016；3．北京回龙观医院中心实验室 100096)

强迫症(obsessive-compulsive disorder，OCD)是以强迫观念，强迫意向，强迫行为为主要临床表现的神经症。普通人群患病率1.1%～3.3%。OCD的病因至今未明，但已有研究显示强迫症具有家族遗传聚集性，患者家属中OCD及亚临床OCD患病率较普通人群高10%～20%[1]。5-HT类基因是OCD的候选基因，然而已有的研究显示5-HT对OCD易感性的影响结论不一，使得研究人员不得不进一步寻找除此之外的其他影响因素[2-3]。Marazziti等[4]研究发现，OCD患者较健康人CD8(TS细胞)明显增多，CD4(Th细胞)明显减少。Barber等[5]研究也发现，男性OCD患者的自然杀伤(NK)细胞升高，都提示OCD患者的免疫系统也发生了改变。编码人肿瘤坏死因子α(TNF-α)的基因定位于6号染色体短臂上，位于MHC-Ⅲ区，现已发现有高度的基因多态性。其多态性表现为两个不同的等位基因形式：将-308位是鸟嘌呤(G)的等位基因定义为常见型TNF1/1，为腺嘌呤(A)时定义为稀少型TNF2，即TNF-308位G被A替换，形成TNF2等位基因形式(包括TNF2/2和TNF1/2)[6]。研究表明，TNF2可以提高TNF-α转录活性而增加TNF-α的产生[7]。多项研究都显示，TNF2等位基因与一系列感染性疾病及自身免疫性疾病有关[8-9]。本研究通过比较分析TNF-α-308基因型在OCD组及健康对照组中的分布，探讨其基因多态性与OCD易感性的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2008年2月至2008年6月重庆医科大学附属第一医院精神科门诊就诊及北京回龙观医院住院的26例OCD患者(OCD组)。其中男12例，平均(32.12±5.39)岁，起病年龄(18.27±4.94)岁，平均病程(5.32±1.74)年；女14例，平均(30.29±6.36)岁，起病年龄(19.36±5.19)岁，平均病程(6.4±2.95)年。入组标准：(1)符合中国精神障碍分类与诊断标准第3版(CCMD-3)中OCD的诊断标准；(2)无器质性疾病；(3)年龄在18～65岁；(4)均为汉族。收集重庆医科大学附属第一医院体检中心的14例健康体检人员及志愿者(健康对照组)。其中，男7例，平均(30.27±5.78)岁；女7例，平均(34.29±7.29)岁。入组标准：年龄18～65岁；无重大躯体疾病，无任何符合诊断标准的精神疾病；既往无精神疾病史，无精神疾病家族史，所有研究对象均无血缘关系。

1.2方法

1.2.1标本收集 抽取肘静脉血2 mL置于含乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的试管中，轻轻摇匀后置于-20 ℃冰箱保存备测。

1.2.2DNA提取 采用Promega生物工程有限公司基因组DNA提取试剂盒，参照说明书步骤进行。

1.2.3PCR扩增 TNF-α基因启动子-308位点引物(引物由北京生工合成)FW：5-′GAG GCA ATA GGT TTT GAG GGC CAT;RV:GGG ACA CAC AAG CAT CAA G-3′，扩增产物长度为147 bp。PCR反应体系:总体积10 μL,含引物(各5 pmol/μL)0.6 μL,10×PCR缓冲液1 μL,DNA(模板)2 μL，taq DNA聚合酶(2.5 U/μL)0.4 μL，脱氧核糖核苷三磷酸(d NTP) 0.2 μL，三蒸水5.2 μL。采用热循环仪，95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s,59 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，循环30次；最后72 ℃ 5 min末次延伸。

1.2.4酶切及电泳 酶切体系总体积10 μL，含PCR扩增产物9 μL，10×缓冲液0.7 μL,限制性内切酶NcoⅠ 0.3 μL(10 U/μL,购至MBI公司)，37 ℃过夜。将产物上样于3%琼脂糖胶，与标准DNA Maker同步电泳，恒定电压120 V电泳50 min后分析结果。酶切后产生3种结果147 bp,147 bp 126 bp 21 bp,126 bp 21 bp,分别代表TNF-α1/1型(终产物为126 bp 1条带，G等位基因纯合子)； TNF-α1/2(终产物为147 bp、126 bp两条带，杂合子)，TNF-α2/2(终产物为147 bp 1条带，A等位基因纯合子)。由于21 bp的条带长度太小，在凝胶上无法分辨，故能够观测到的是147 bp和126 bp两个条带。

1.3统计学处理 采用SPSS15.0统计软件进行分析，采用χ2检验或Fisher精确概率法。将TNF-α-308基因型等位基因TNF-α1/1及1/2型以四格表进行χ2检验，计算比值比(OR)和95%CI，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1PCR质量控制结果 随机抽取5例样本，重复检测基因型结果与前完全一致，证明本试验结果可靠。

2.2TNF-α-308位基因多态性PCR结果 其中1泳道为TNF1纯和基因型；2泳道为TNF2纯和基因型；5泳道为TNF1/2杂合型，见图1。

1、2、4：TNF-α1/1纯合基因型；3：DNA Marker；5：TNF-α1/2杂合基因型。

图1 TNF-α基因启动子-308位点3%琼脂糖胶电泳图

2.3两组Hardy-Weinberg遗传平衡吻合度检验 OCD组TNF-α基因型分布的观察值和期望值吻合度良好，差异无统计学意义(P>0.05)；健康对照组TNF-α基因型分布的观察值和期望值吻合度良好；均符合Hardy-Weinberg遗传平衡法则。

2.4OCD和健康人TNF-α基因检测结果 本实验结果TNF-α基因启动子区域-308位点只发现TNF-α1/1型及TNF-α1/2型两种基因型，未发现TNF-α2/2基因型。TNF的基因型在OCD组及健康对照组中分布均以1/1型纯合子占优势，OCD组为16.7%(TNF1/2)和83.3%(TNF1/1)，而健康人中全为TNF1/1型。两组之间的基因型频率分布的比较，差异有统计学意义(χ2=15.73，P<0.01)。

2.5两组TNF-α-308 位基因多态性与OCD的相关分析 OCD组与健康对照组的差异主要来自G等位基因，差异有统计学意义(P<0.01)，使其患OCD的危险性提高了1.93倍。因此，等位基因G与OCD易感性存在正相关。

3 讨 论

已有许多研究提示，免疫系统在包括抑郁、痴呆、精神分裂症等精神疾病的发生、发展中所起的作用，一些焦虑的疾病包括创伤后应激障碍、惊恐障碍、社交恐惧和OCD患者[10-11]。人们很早就注意到免疫系统在精神疾病中的病理生理作用。近年来的研究表明，细胞因子特别是TNF-α参与了急、慢性神经退行性变，并且与神经递质尤其是儿茶酚胺系统的平衡有相互作用。TNF-α是具有多种生物学效应的一种细胞因子，不仅对肿瘤细胞有细胞毒、细胞溶解、抑制增殖等作用，还影响多种正常细胞的生长分化。另外，TNF-α还是一种重要的炎性介质，参与免疫病理反应，在机体免疫-炎症协调的信号网络调节中起重要作用，还通过迷走神经对中枢产生直接和间接的影响[12]。

人类细胞因子基因多态性数据库已报道了其启动子区的8个单核苷酸多态性(SNP)位点，且一些SNP位点的等位基因与某些感染性和自身免疫性疾病相关[13]。TNF-α基因启动子区域多态性分布是非随机性的，而很可能与选择性的功能表达相关[14]。有研究首先报道了TNF-α基因启动子区域内-308位点的双等位基因多态性， -308位点的G-A突变在高加索人种中出现频率高，较早就已成为研究热点[15-16]。Louis等[6]发现，用脂多糖刺激TNF-α-308-2等位基因携带者个体的血细胞与TNF-α-2等位基因相比较，能产生较多量的TNF-α，表明TNF-α-308-2等位基因携带者由于TNF-α诱导表达水平增高，可能增加相关疾病的易感性。虽然TNF-α对疾病具有重要意义，但-308位点G-A突变发生率相当低。据报道，在新西兰，健康人群TNF-α基因该位点突变率发生率为5.3%[17]。笔者采用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)法对TNF-α基因多态性进行分析发现，在OCD患者中点突变的发生率为16.7%，健康人中没有发现点突变，可能与样本量较小有关。OCD组TNF-α点突变显著高于对照组，结果与Konuk等[18]的研究相似。而Monteleone等[19]的研究发现，在血浆IL-1β及IL-6的水平与健康对照组都没有发现显著性差异，而OCD患者的TNF-α水平显著高于健康对照组，差异有统计学意义(P=0.001)。

综上所述，TNF-α等位基因可能与OCD的易感性相关， TNF-α的功能为基因频率在临床上可作为遗传性标记进行检测，对于预防早期OCD的发展具有重要意义。但本研究没有考虑其他细胞因子的多态性位点及其他危险因素的影响，不能排除TNF-α-308位点与其他细胞因子的位点基因连锁而成为OCD易感性相关的遗传标志，还有待于扩大样本进行多因素分析。

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