术前外周血NLR对上皮性卵巢癌患者预后的影响

张文琪 郝 权

术前外周血NLR对上皮性卵巢癌患者预后的影响

张文琪 郝 权

目的：评价术前外周血中性粒细胞/淋巴细胞比值（neutrophit-to-lymphocyte ratio，NLR），对上皮性卵巢癌患者预后的预测意义。方法：回顾性分析天津医科大学肿瘤医院80例上皮性卵巢癌患者的临床病理资料，通过建立受试者工作特征曲线（ROC曲线），确定术前外周血NLR预测术后生存的最佳截点，以此将患者分为低NLR和高NLR两组，分析NLR与患者的临床病理特征之间的关系，并通过单因素及多因素分析评估术前外周血NLR对患者术后生存的影响。通过免疫组织化学法验证术前NLR与肿瘤相关巨噬细胞浸润的关系。结果：术前NLR预测患者术后生存时间的最佳截点为3.8。术前低NLR组（NLR≤3.8）与高NLR组（NLR＞3.8）患者在FIGO分期的差异有统计学意义（P＜0.005），而在其他的各项临床病理特征间差异均无统计学意义。80例上皮性卵巢癌术后中位生存时间为45个月，术后1、3年生存率分别为93.7%、60.0%。单因素分析结果显示：术前NLR＞3.8（P＜0.005）及术后FIGO分期为Ⅲ～Ⅳ期（P＜0.005）是影响患者术后总体生存以及无瘤生存期的危险因素。多因素分析显示：术前NLR＞3.8（P＜0.05）及术后FIGO分期为Ⅲ～Ⅳ期（P＜0.05）为上皮性卵巢癌患者术后预后不良的独立危险因素。免疫组织化学法表明肿瘤相关巨噬细胞在术前高NLR组54.65±8.78与低NLR组41.78±9.10之间的差异有统计学意义（P＜0.001）。结论：术前NLR升高提示患者预后不良，是影响上皮性卵巢癌患者预后的独立危险因素。

卵巢癌 中性粒细胞/淋巴细胞比值 预后 总体生存时间 肿瘤相关巨噬细胞

卵巢癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，由于其发病隐匿，早期症状不典型以及缺乏早期诊断方法，大部分发现时已是晚期。晚期卵巢癌恶性程度高，预后差，病死率居女性生殖系统恶性肿瘤之首，因此，卵巢癌的早期诊断及早期治疗具有极其重要的意义。越来越多的研究表明，肿瘤相关炎症是影响肿瘤患者预后的重要因素。作为反映全身炎症反应的评价指标之一，中性粒细胞/淋巴细胞比值（neutro-phil-to-lymphocyte ratio，NLR）已被证实是结直肠癌、乳腺癌、软组织肉瘤等多种恶性肿瘤患者的独立预后因素之一［1-5］。但目前升高的NLR对于上皮性卵巢癌患者预后影响的研究不多。本研究系统性的回顾性了80例上皮性卵巢癌患者的临床病理资料，探讨术前NLR值对患者术后生存的影响及预测意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集2007年1月至2009年1月于天津医科大学肿瘤医院行上皮性卵巢癌手术患者80例纳入该回顾性研究，患者年龄（27～83）岁，平均年龄为55.4岁。收集患者的其他资料包括年龄、术前CA125水平、术前1周内血常规化验结果，术后病理资料包括肿瘤大小、病理类型、分化程度、术后FIGO分期等资料。肿瘤的组织类型由病理医师根据WHO分类进行评估，而肿瘤术后FIGO分期则根据国际妇产科联盟2010年修订的FIGO分期标准，由妇科肿瘤专科医生、术者术中以及病理医生术后进行多学科评估。

1.2 方法

1.2.1 病例排除标准 术前1周内无血常规资料；术前有急/慢性感染或严重出血证据；伴有血液系统恶性肿瘤；围手术期因手术并发症死亡，如感染性休克。1.2.2 随访情况 术后随访内容包括病史收集、全身体格检查及盆腔检查、肿瘤标记物、盆腹腔超声、CT，每2～4个月进行1次，持续2年。后3年每3～6个月1次，5年后每年1次。总生存时间（OS）定义为从手术日期至死亡或随访结束日。复发的诊断以影像学检查（B超、CT、MRI、PET-CT等）发现复发或转移病灶为准，单纯的CA125升高不作为复发时间出现的标准。DFS定义为从手术日期至确诊复发日期之间月数。

1.2.3 免疫组织化学法 80例上皮性卵巢癌标本均经10%中性福尔马林固定，常规脱水、石蜡包埋，4 μm切片。组织脱蜡至水，高压修复2.5 min（修复液为pH6.0、浓度为10 mmol/L枸橼酸盐溶液），冷却至室温。3%过氧化氢室温封闭内源性过氧化氢酶20 min。PBS洗涤3次后，加入抗CD68（1：300稀释，Abcam，Cambridge，MA，USA）一抗，4℃孵育过夜。二抗37℃孵育30 min；DAB显色；苏木精复染、脱水、透明，中性树胶封片。结果判断：采用盲法（即统计人员不清楚患者的临床病理参数）对结果进行判定。于1物镜（×100）下选取5个“热点”区域，然后在物镜（×400）下计数CD68阳性细胞、取平均值。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。ROC曲线法确定NLR的临界值，对服从正态分布的计量资料，用（均值±标准差）进行描述，对非正态分布的连续性资料，采用中位数（极差）进行描述。计数资料采用χ2和Fisher's确切概率法进行各组间的比较。生存分析中生存率的计算采用Kaplan-Meier法，组间生存率比较采用Log-rank检验，Cox比例风险模型分析检验影响预后的独立因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者一般情况

80例患者术后病理类型：卵巢浆液性囊腺癌42例，黏液性囊腺癌5例，宫内膜样腺癌26例，透明细胞癌7例；FIGO分期：Ⅰ～Ⅱ期27例，Ⅲ～Ⅳ期53例。中位随访时间为45（1～67）个月。所有患者中，47例为盆腔内复发和（或）转移病灶。术后1、3年生存率分别为93.7%、60.0%。

2.2 NLR最佳截点的确定

80例患者术前外周血NLR为3.72±2.46。根据ROC曲线（图1），当NLR为3.8时，约登指数最大为0.488，故取3.8作为NLR的最佳截点，其评估本组患者术后生存情况的敏感度为66.7%，特异度为82.1%，曲线下面积为0.771。以3.8为截点，术前NLR＞3.8者26例，占32.5%。

图1 确定术前NLR最佳截点的ROC曲线Figure 1 Identification of the best cut-off value of preoperative NLR with ROC curve

2.3 NLR与患者临床病理特征的关系

术前低NLR组与高NLR组相比，在术后FIGO分期上的差异具有统计学意义（P＜0.005），而在其他临床病理特征之间差异均无统计学意义（表1）。

2.4 影响术后无瘤生存期和总体生存期的单因素分析

Log-rank单因素分析显示，术前NLR＞3.8以及术后FIGO分期为Ⅲ～Ⅳ期是影响上皮性卵巢癌患者术后无瘤生存期以及总生存时间的危险因素（表2，图2～3）。

2.5 影响术后无瘤生存期和总体生存期的多因素分析

将影响上皮性卵巢癌患者术后无瘤生存期以及总生存时间的危险因素中术前NLR＞3.8以及术后FIGO分期为Ⅲ～Ⅳ期调入Cox比例风险模型，结果显示，NLR＞3.8以及术后FIGO分期为Ⅲ～Ⅳ期是预测患者术后总体生存时间的独立危险因素（表3）。

表1 80例上皮性卵巢癌患者术前低NLR组与高NLR组的临床病理特征Table 1 Clinicopathological characteristics of 80 patients with EOC with low or high NLR at surgery

表2 80例上皮性卵巢癌患者术后总体生存与无瘤生存期影响因素的单因素分析Table 2 Univariate analysis of the factors affecting the survival of 80 patients with EOC after surgery

图2 低NLR组与高NLR组患者PFS曲线Figure 2 Comparison of the PFS curves of cases with low and high NLR

2.6 术前NLR与肿瘤相关巨噬细胞表达的关系

肿瘤相关巨噬细胞大部分位于癌旁间质（图4A～B）。肿瘤相关巨噬细胞在术前高NLR组为54.65±8.78与低NLR组为41.78±9.10之间的差异具有统计学意义（P＜0.001，图4C）。

图3 低NLR组与高NLR组患者OS曲线Figure 3 Comparison of the OS curves of the cases with low and high NLR

表3 80例上皮性卵巢癌患者术后生存影响因素的Cox多因素分析Table 3 Multivariate Cox-proportional hazard regression analysis of the prognostic factors for survival of 80 patients with EOC after surgery

A：Expressions of TAMs in ovarian tissues from cases with low NLR；B：Expressions of TAMs in ovarian tissues from cases with high NLR；C：Number of TAMs differed significantly between low and high NLR groups（*P＜0.001）

3 讨论

卵巢癌是妇科最常见的三大恶性肿瘤之一，其复杂的肿瘤微环境是影响卵巢癌预后的重要因素之一。越来越多的研究证实，慢性炎症在卵巢癌的发生、发展中起着重要的作用。炎症导致细胞损伤、氧化应激、前列腺素的升高，进而导致基因突变（如p53基因）发挥促进肿瘤发生发展的作用。像Balkwill［6］等所形容的那样，如果基因损伤点燃了肿瘤形成的火花，那随之而来的炎症反应就像不断供给的燃料。近年来，许多研究关注了能够反映系统性炎症反应的临床常用指标，如C-反应蛋白、白蛋白，以及基于这些指标的GPS评分，并在对患者进行分层治疗以及预测肿瘤患者的预后方面有重要的指导意义。已经有研究证实，升高的CRP是原发直肠癌行直肠癌根治术患者术后独立的预后因素［7］。但是，卵巢癌患者一般不常规检测C-反应蛋白，相比而言，用外周血白细胞计数来反映和检测肿瘤患者系统性炎症反应程度比其他指标更简便易行且具有实际意义［8］。因此，常用中性粒细胞计数及淋巴细胞计数的比值来反映肿瘤患者系统性炎症反应。

目前，国内外有关NLR对卵巢癌患者术后生存预测的研究相对较少。Cha等［9］对比了卵巢良、恶性疾病中不同白细胞种类的表达以及NLR对患者生存的影响，指出联合术前外周血中NLR与CA125水平能够提高早期卵巢癌的检出率，从而有利于卵巢癌的早期诊断早期治疗。该研究还指出，NLR是影响卵巢癌患者术后复发以及总体生存的独立危险因素，无论是在单因素分析中还是多因素分析中都具有重要的预测意义。除此之外，Thavaramara等［10］进一步指出，相比于总体生存时间，术前NLR能够更好地预测上皮性卵巢癌患者术后的无瘤生存期。

本研究中，运用ROC曲线法确定术前NLR预测术后生存的最佳截点为3.8，曲线下面积为0.771，说明该指标对术后生存有较好的预测价值。根据最佳截点将患者分为低NLR及高NLR两组，两组患者的NLR在术后FIGO分期上的差异具有统计学意义，而其他各临床病理特征则相似。对上皮性卵巢癌患者进行单因素分析结果显示：术前NLR＞3.8是上皮性卵巢癌患者术后无瘤生存期以及总生存时间的危险因素，提示这部分患者机体免疫状态不佳、肿瘤恶性程度较高，预后较差。Cox多因素分析显示：术前NLR＞3.8以及术后FIGO分期为Ⅲ～Ⅳ期是预测患者术后总体生存时间的独立危险因素。卵巢癌患者的术后生存时间不仅仅取决于FIGO分期，也受到术前NLR的影响，充分说明机体免疫系统在卵巢癌的免疫监视中扮演着重要角色。基于此，本研究认为通过提高自身免疫、增强营养状况或许能够改善卵巢癌患者的预后。

NLR影响肿瘤患者预后的具体机制不甚明确，一种解释是宿主的抗肿瘤免疫反应是淋巴细胞依赖性的，NLR升高的患者，往往伴有淋巴细胞计数相对减少，降低了其介导的抗肿瘤反应，进而形成了适合癌细胞增殖及转移的环境，导致患者预后不良；另一方面，中性粒细胞被认为是循环中血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的主要来源，VEGF的过表达促了进肿瘤血管的生成，有利于肿瘤的生长、转移。当然，NLR的增高不一定是中性粒细胞或者淋巴细胞单一比例失衡造成的，可能更重要的是扮演着一个促肿瘤炎症反应与抗肿瘤免疫反应的平衡状态。

肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages TAMs）是构成肿瘤局部炎性微环境的重要组成部分［11］。TAMs来源于外周循环中的单核细胞，单核细胞的招募、分化、存活和增殖组成了TAMs形成的全过程［12］。TAMs通过上调金属基质蛋白酶等的活性促进肿瘤的迁徙与转移。同时，通过介导FoxP3阳性调节性T细胞的扩增来下调机体的抗肿瘤免疫反应［13］。Motomura等［14］在探讨肝细胞癌患者肝移植术后NLR升高的相关机制时曾指出，外周血中NLR的升高通常伴有IL-17水平上升及癌旁浸润的TAMs的增加。因此，在本研究中，通过免疫组织化学法探讨了在上皮性卵巢癌中术前NLR与TAMs表达的关系。结果显示，术前NLR的升高往往也伴随着TAMs浸润数目的增多。这可能是因为TAMs在肿瘤局部低氧环境中分泌VEGF、CXC趋化因子12及其受体CXCR4，促进单核细胞以及中性粒细胞的招募以及通过介导FoxP3阳性调节性T细胞的扩增下调机体的抗肿瘤免疫反应。

另外，学术界对采用血清CA125水平来预测卵巢癌患者术后生存尚存在争议。Paramasivam等［15］曾报道术前血清CA125＞30 U/mL为I期卵巢癌患者术后的独立预后因素（HR=2.40，95%CI：1.26～4.59，P= 0.028），但是在本研究中，Cox多因素分析显示术前CA125水平不能作为患者预后的独立危险因素。这可能是由于肿瘤的病理类型、分化程度以及肿瘤自身特征不同所导致的。

总之，NLR作为一种新的卵巢癌血清生物学指标，具有简单方便、快捷经济的优点，但是在利用NLR评估预后时不能仅凭此单一指标，应结合多种指标进行综合分析。由于目前国内外该类研究较少，因此术前外周血NLR测定对卵巢癌预后的预测价值及参考值，尚需多中心、大样本量的临床证实。

1 Ozdemir Y,Akin ML,Sucullu I,et al.Pretreatment neutrophil/lymphocyte ratio as a prognostic aid in colorectal cancer[J].Asian Pac J Cancer Prev,2014,15(6):2647-2650.

2 Azab B,Shah N,Radbel J,et al.Pretreatment neutrophil/lymphocyte ratio is superior to platelet/lymphocyte ratio as a predictor of long-term mortality in breast cancer patients[J].Med Oncol,2013, 30(1):432-442.

3 Szkandera J,Absenger G,Liegl-Atzwanger B,et al.Elevated preoperative neutrophil/lymphocyte ratio is associated with poor prognosis in soft-tissue sarcoma patients[J].Br J Cancer,2013,108(8): 1677-1683.

4 Urrejola GI,Bambs CE,Espinoza MA,et al.An elevated neutrophil/lymphocyte ratio is associated with poor prognosis in stage II resected colon cancer[J].Rev Med Chil,2013,141(5):602-608.

5 Gondo T,Nakashima J,Ohno Y,et al.Prognostic value of neutrophil-to-lymphocyte ratio and establishment of novel preoperative risk stratification model in bladder cancerpatients treated with radical cystectomy[J].Urology,2012,79(5):1085-1091.

6 Balkwill F,Mantovani A.Inflammation and cancer:back to Virchow[J]?Lancet,2001,357:539-545.

7 Gunter MJ,Stolzenberg-Solomon R,Cross AJ,et al.A prospective study of serum C-reactive protein and colorectal cancer risk in men [J].Cancer Res,2006,66(4):2483-2487.

8 Proctor MJ,Morrison DS,Talwar D,et al.A comparison of inflammation-based prognostic scores in patients with cancer.A Glasgow Inflammation Outcome Study[J].Eur J Cancer,2011,47(17): 2633-2641.

9 Chao H,Hur HW,Kim SW,et al.Pre-treatment neutrophil to lymphocyte ratio is elevated in epithelial ovarian cancer and predicts survival after treatment[J].Cancer Immunol Immunother, 2009,58(1):15-23.

10 Thavaramara T,Phaloprakarn C,Tangjitgamol S,et al.Role of neutrophil to lymphocyte ratio as a prognostic indicator for epithelial ovarian cancer[J].J Med Assoc Thai,2011,94(7):871-877.

11 Tang XQ,Mo CF,Wang YS,et al.Anti-tumour strategies aiming to target tumour-associated macrophages[J].Immunology,2013, 138(2):93-104.

12 Mantovani A,Allavena P,Sica A.Tumour associated macrophages as a prototypic Type II polarised phagocyte population:role in tumour progression[J].Eur J Cancer,2004,40(11):1660-1667.

13 Hasita H,Komohara Y,Okabe H,et al.Significance of alternatively activated macrophages in patients with intrahepatic cholangiocarcinoma[J].Cancer Sci,2010,101(8):1913-1919.

14 Motomura T,Shirabe K,Mano Y,et al.Neutrophil-lymphocyte ratio reflects hepatocellular carcinoma recurrence after liver transplantation via inflammatory microenvironment[J].J Hepatol,2013,58 (1):58-64.

15 Paramasivam S,Tripcony L,Crandon A,et al.Prognostic importance of preoperative CA-125 in International Federation of Gynecology and Obstetric stage I epithelial ovarian cancer:an Australian multicenter study[J].J Clin Oncol,2005,23(25):5938-5942.

（2013-06-04收稿）（2013-10-24修回）

Preoperative blood neutrophil to lymphocyte ratio as an independent prognostic predictor for epithelial ovarian cancer

Quan HAO;E-mail:haoquandoctor@163.com

Department of Gynecologic Oncology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer,Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin,Tianjin 300060,China

Objective:This study aims to evaluate the effect of an elevated preoperative neutrophil to lymphocyte ratio(NLR)on outcome after comprehensive staging laparotomy or optimal tumor debulking surgery for epithelial ovarian cancer(EOC)and determine the value of the NLR as an independent prognostic prediction marker.Methods:A total of 80 women with primary EOC and with complete clinical and pathological information documented at the time of surgery were selected for this study.The optimum cut-off value of the preoperative NLR was identified through receiver operator characteristic(ROC)curve,and the patients were then classified into two groups:low and high NLR group.Univariate and multivariate analyses were performed to assess the prognostic effect of the preoperative NLR patients who underwent comprehensive staging laparotomy or optimal tumor debulking surgery.The levels of expression of CD68 were measured through immunohistochemistry.Results:The optimal cut-off value of the NLR was 3.8. The preoperative NLR differed significantly in the FIGO stage between the low NLR group(NLR≤3.8)and the high NLR group (NLR>3.8),but no discrimination was observed in other parameters.The mean follow-up time was 45 months,and the post-operative 1-and 3-year survival rates were 93.7%and 60.0%,respectively.The preoperative NLR>3.8 and stageⅢ/Ⅳwere all risk factors for poor overall and disease-free survival.Multivariate analysis revealed the patients with high NLR(P<0.05)and stageⅢ/Ⅳ(P<0.05) had prognostic significance for poor overall survival.The number of CD68-positive tumor-associated macrophages was significantly higher in the high NLR group than in the low NLR group(54.65±8.78 and 41.78±9.10,respectively;P<0.001).Conclusion:An elevated blood preoperative NLR indicates poor prognosis in patients with EOC.Preoperative NLR may function as an important independent prognostic factor for patients with EOC.

ovarian cancer,neutrophil to lymphocyte ratio,prognosis,overall survival,tumor-associated macrophages

10.3969/j.issn.1000-8179.20130874

天津医科大学肿瘤医院妇科肿瘤科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室（天津市300060）

郝权 haoquandoctor@163.com

Wenqi ZHANG,Quan HAO

杨红欣）

张文琪 硕士研究生。研究方向为妇科良、恶性肿瘤的临床诊治与研究。

E-mail：wenqi zhang 2008@126.com

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