基于代谢组学的抗心绞痛常见药物的比较

邵卫绪

（山东省蓬莱市中医院急诊科，蓬莱 265600）

基于代谢组学的抗心绞痛常见药物的比较

邵卫绪

（山东省蓬莱市中医院急诊科，蓬莱 265600）

目的 采用基于气相色谱－质谱 （GC－MS）的代谢组学技术比较并评价单硝酸异山梨酯，曲美他嗪，复方丹参滴丸三种药物抗心绞痛作用机制。方法 40只SD大鼠分为模型组、正常对照组、单硝酸异山梨酯组、曲美他嗪组、复方丹参滴丸组5组，采用GC－MS技术对不同组别大鼠的血浆进行分析。并利用SIMCA－P软件对不同组之间代谢产物含量变化进行主成分分析 （PCA）和偏最小二乘法判别分析 （PLS－DA），初步揭示心绞痛生物标志物，为心绞痛药物筛选提供新的方法。结果 代谢组学分析结果显示，模型组大鼠血浆中琥珀酸、延胡索酸、葡萄糖、柠檬酸、乳酸、尿素、甘氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸及肌苷等内源性代谢物有差异性变化（P＜0.05），可视为心绞痛生物标志物。PCA和PLS－DA统计结果显示曲美他嗪组距离正常对照组最近，且所能回调的标志物较其他两组多，其抗心绞痛效果较优。结论 三种药物都有明显的抗心绞痛效果，曲美他嗪效果较优；运用代谢组学技术分析了三种药物抗心绞痛有关标志物的调节作用并对其机制进行了初步比较研究，为药物药效的评价提供了新思路和新方法。

代谢组学；心绞痛；气相色谱－质谱

心绞痛是临床常见疾病，是由于冠状动脉粥样硬化引起冠状动脉管腔狭窄、部分堵塞或冠状动脉痉挛而造成心肌供氧不足所致［1－2］。目前，单硝酸异山梨酯，曲美他嗪，复方丹参滴丸为我院临床上应用最广的三种抗心绞痛药物，其在临床上均对心绞痛具有确切的疗效［3］。但目前对三者的研究大多是从临床角度进行探讨，不能全面反映药物调节机体的过程，因此，本实验采用GC－MS技术分析单硝酸异山梨酯组、曲美他嗪组、复方丹参滴丸组大鼠的血样成分变化，结合多变量统计分析，联系机体物质和能量代谢的代谢通路和代谢网络［4］，进一步阐释三者的干预机制，具有整体性和多靶点性，以期为临床合理用药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级SD成年雄性健康大鼠40只，体重 （200±20）g，购于北京斯贝福实验动物科技有限公司，动物许可证：SCXK （京）2011－0004。

1.2 仪器 气相色谱质谱联用仪 （GCMS－QP2010，日本岛津公司）；DB－5MS气相毛细管色谱柱 （安捷伦科技有限公司）；QL－901型微型漩涡混合器 （江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司）；KQ－500DE型数控超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）；Sartorious BT 25S型电子分析天平 （北京赛多利斯仪器有限公司）；CENCO型涡旋仪 （荷兰Breda公司），Biofuge Stratos型低温高速离心机 （德国Heracus公司）。

1.3 试剂与试药 单硝酸异山梨酯片 （山东鲁南贝特制药有限公司）；盐酸曲美他嗪片 （施维雅制药有限公司）；复方丹参滴丸 （天津天士力股份有限公司）；衍生化试剂：BSTFA＋1%TMCS，甲氧胺盐酸盐，吡啶 （美国Sigma公司）；屈臣氏蒸馏水。

1.4 方法

1.4.1 动物造模与分组 取雄性SD大鼠，参照文献方法，采用结扎冠状动脉左前降支诱导心绞痛模型［5］。取造模成功大鼠32只，将其随机分为4组，包括模型组、单硝酸异山梨酯组，曲美他嗪组，复方丹参滴丸组，每组8只；另取8只未施行手术的SD雄性大鼠为正常对照组。

1.4.2 给药方法及取材 造模第二天开始灌胃给药，每日1次，复方丹参滴丸组100mg/kg，单硝酸异山梨酯组、曲美他嗪组均为20mg/kg，模型组、正常对照组给予等量的饮用水，1mL/kg。连续给药4周，于第28天，眼眶取血，肝素钠抗凝，取血浆，置－80℃冰箱保存。

1.4.3 样本的GC－MS分析 GC－MS样本预处理：实验前1h取大鼠血浆样品常温下解冻溶解，吸取100∶L血浆于离心管中；加入10μL内标 （十七酸甲醇溶液，6mg/mL），再加入有机溶剂 （甲醇∶氯仿＝3∶1）300μL，涡旋震荡1min；将混合液置于－20℃冰箱中10min，取出后离心 （13000r/min，4℃）10min，取上清液于进样瓶中，氮气吹干。取挥干的样品加入20mg/mL甲氧胺吡啶溶剂50μL混匀；在30℃下摇床 （200rpm）中反应2h；加入80μL的BSFTA （含1%TMCS），振荡30s；70℃水浴反应1h后涡旋混匀，室温下放置1h后待GC/MS进样分析。

色谱和质谱条件：气相条件：色谱柱：DB－5MS（30m×0.25mm×0.25μm）毛细管柱；进样口温度：260℃；分流比为2∶1；升温程序：80℃，保持2min，以10℃/min升至140℃，以4℃/min升至240℃，再以10℃/min升至280℃，保持3min；载气流速：1.0mL/min；载气：高纯度氦气；进样量：1μL。质谱条件：接口温度：280℃；电离方式：EI；离子源温度：220℃；电子能量70 eV；扫描范围：50～600 m/z。

1.4.4 代谢组学数据分析 根据GC/MS总离子流图中各峰保留时间挑选有效物质峰，对各峰进行积分。利用NIST 5质谱数据库对总离子流图中各个物质峰对应的内源性物质进行鉴定，内源性物质含量直接用图中相应物质峰的峰面积来表示。将每个样本的处理结果导入SIMCA－P 12.0软件进行主成分分析 （PCA）以及偏最小二乘判别分析 （PLS－DA）。通过载荷图中的VIP值 （每个主成分变量对分开各组的贡献大小）来寻找生物标志物。VIP值＞1被认为是判断有意义物质的标准。

2 结果

2.1 GC－MS分析结果 总离子流图：大鼠血浆GC－MS分析总离子流图如下图1所示。

图1 大鼠血浆GC－MS分析总离子流图

2.2 代谢物鉴定 利用NIST 5质谱数据库对内源性代谢物作鉴定，以通常匹配度＞80%的鉴定结果作为较为可信的物质。挑选共有峰后发现大鼠血浆内共有内源性代谢物29种，包括：乳酸、3－羟基丁酸、缬氨酸、磷酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸、赖氨酸、肌醇、甘氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、尿素、丙氨酸、葡萄糖、核糖醇、亚油酸、油酸、十六烷酸、延胡索酸、谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷、脯氨酸、甜菜碱。

2.3 各组间模式识别分析 正常对照组、模型组和三种药物干预组之间PCA及载荷图统计结果表明 （见图2，4），模型组、正常对照组、单硝酸异山梨酯组、曲美他嗪组、复方丹参滴丸组之间基本无交叉和重叠。同时三种药物干预组均有向正常对照组靠近的趋势。其中，曲美他嗪组距离正常对照组较近，其抗心绞痛效果较优。

采用PLS－DA对正常组、模型组两组间差异代谢物进行分析得出，与正常对照组对比，模型组中肌醇、尿素、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷、乳酸、3－羟基丁酸、磷酸、亚油酸、葡萄糖、油酸、核糖醇、十六烷酸浓度升高；缬氨酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸、赖氨酸、甘氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、延胡索酸、谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甜菜碱浓度降低。从VIP值观察重要的依次是琥珀酸、延胡索酸、葡萄糖、柠檬酸、乳酸、尿素、甘氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸及肌苷。在曲美他嗪组大鼠血浆中，3－羟基丁酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸、丝氨酸、延胡索酸、谷氨酸、色氨酸、肌苷、葡萄糖10种代谢产物含量有显著性差异 （与模型组比较，P＜0.05）。单硝酸异山梨酯组大鼠血浆中丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、甘氨酸5种代谢产物与模型组比较含量显著增加。复方丹参滴丸组大鼠血浆中丝氨酸、葡萄糖、亚油酸、油酸、十六烷酸、次黄嘌呤、黄嘌呤7种代谢产物回调至接近于正常水平。

图2 五组大鼠血浆之间的PCA主成分分析图

图3 代谢物变化模式识别得分图

图4 组间载荷图

2.4 各组发生改变的代谢产物含量比较 由表1可以看出，模型组大鼠给予药物治疗后，总体水平上观察，标志物含量均呈现由模型组到正常水平的回复趋势。每种药物对标志物水平的影响又不尽相同。这说明，3种药物对于心绞痛均有较好的治疗效果，但由于每种药物的作用机制不同，不同类型的药物对标志物的干预具有特异性。其中，曲美他嗪组所回调的标志物种类及含量都较其他两组多，其抗心绞痛效果较优。

表1 各组间差异代谢物变化

3 讨论

3.1 正常对照组和模型组的生物标志物指认 与正常对照组比较发现，模型组大鼠血浆代谢谱发生了显著性变化，其中延胡索酸等15种代谢物的表达低于正常对照组中的表达；而葡萄糖等14种代谢物高于正常对照组的含量。其中，模型组大鼠血浆中琥珀酸、延胡索酸、葡萄糖、柠檬酸、乳酸、尿素、甘氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸及肌苷等内源性代谢物有差异性变化，可视为心绞痛生物标志物。

3.2 三种药物对潜在生物标志物的回归调节分析 从传统的作用机制上看，单硝酸异山梨酯和曲美他嗪是常见的硝酸酯类和曲美他嗪类西药，分别通过松弛血管平滑肌和改变能量代谢途径发挥作用［5］，复方丹参滴丸是临床常见的中药制剂，活血化瘀、理气止痛，具有扩张冠状动脉、增加冠脉血流量的作用［6－7］。

本实验心绞痛模型组大鼠经过单硝酸异山梨酯干预后有5种代谢物与模型组相比发生显著性改变：甘氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸。推测单硝酸异山梨酯对氨基酸代谢通路具有一定的调节作用。曲美他嗪干预后有10种代谢物质变化显著，其中琥珀酸等4项指标与细胞内三羧酸循环密切相关。其水平的上升考虑是心肌细胞有氧代谢功能的恢复。而丝氨酸、谷氨酸、色氨酸等则通过几步转化间接干预糖酵解、三羧酸循环和戊糖磷酸途径。复方丹参滴丸组与模型组对比，变化的代谢物有丝氨酸、葡萄糖、亚油酸、油酸、十六烷酸、次黄嘌呤、黄嘌呤7种内源性代谢物，其中涉及到糖代谢、嘌呤代谢、脂类代谢等多种代谢通路，说明复方丹参滴丸具有多组分、多环节、多靶点的心血管保护作用。

代谢组学是研究许多病症发病机制和作用机制的良好平台，能够全面研究机体新陈代谢活动链上的终产物的变化，然后将这些多维代谢轨迹与病理生理过程中的生物学事件联系起来，反映生物体系的状态［9］。基于GC－MS的代谢组学技术从代谢角度研究三种常见抗心绞痛药物治疗机制，为将来评价和预测不同治疗方式的远期疗效提供了一定的参考价值和理论依据［10］。

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［3］项志敏.冠心病的防治策略及其合理用药原则［J］.中国社区医师，2011，31（4）：16.

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Metabolomic Based Comparison Study on Angina Pectoris Treated with Common Drugs

Shao Weixu
（Emergency Department，Traditional Chinese Medicine Hospital of Penglai，Penglai265600，China）

ObjectiveTo compare the different mechanism between isosorbide 5－mononitrate，Trimetazidine and Compound Danshen Dropping Pills in treatment for angina pectoris using GC－MS by metabolomic approach.MethodsForty SD rats were equally divided into the model group，the blank control group，the isosorbide 5－mononitrategroup，the Trimetazidine group，and the Compound Danshen Dropping Pills group.Changes of metabolite contents were analyzed among different groups using GC－MS via principal component analysis（PCA）and partial least squares analysis（PLS－DA）using the SIMCA－P software.Biomarkers of angina pectoris injury are initially revealed.The metabolomics study could offer a new method and tool for angina pectoris.ResultsMetabolomic analysis showed that the Trimetazidine group located closer to the blank control group，showing better efficacy than the other two groups.More perturbed metabolites were reversed by Trimetazidine group.In the plasma of rats，succinic acid，2－butenedioic acid，d－glucose，citric acid，lactic acid，urea，glycine，phenylalanine，l－isoleucine，creatinine，and so on had significant changes before and after myocardial ischemia.ConclusionsThree drugs have significant efficacy，and Trimetazidine shows best effect.Metabolomic approach was applied in this study to analyze the regulation of biomarkers and compare the mechanisms of the three drugs.These results provide new methods for the evaluation of drug efficacy.

metabolomics；Angina pectoris；Gas chromatography－mass spectrometry

10.3969/j.issn.1672－2779.2014.10.060

1672－2779（2014）－10－0100－03

苏 玲 本文校对：张春华

2014－02－15）