新生SD大鼠心肌细胞的原代培养及荧光鉴定

姬婷婷，徐 岩，张建华，赵 勇

心肌细胞原代培养是指在体外适宜的条件下使心肌细胞生长，并保留一定的结构和功能特性。其作为一种体外实验研究模型，已应用于许多研究，如细胞凋亡、缺氧缺血再灌注模型等，培养技术及方法的不同导致新生大鼠心肌细胞原代培养效果差异较大，因此建立一种简单、稳定、有效的培养方法是必要的。该研究参照Golden et al［1］的原代心肌细胞培养方法并加以改进，形成一种简单、稳定、有效的方法，为心肌细胞体外培养提供了有效的技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选择1～3日龄健康SD大鼠10～15只，清洁级，雌雄不限，由安徽医科大学实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂 高糖 DMEM、胎牛血清(美国Hyclone公司);胰蛋白酶(美国Invitrogen公司);兔抗大鼠肌钙蛋白Ⅰ多克隆抗体(英国Abcam公司);小鼠抗大鼠α-Sarcomeric actin单克隆抗体(北京博士德公司);FITC标记山羊抗兔IgG抗体、FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体、山羊封闭血清(北京中杉金桥生物技术有限公司);Triton X-100、台盼蓝(美国Sigma公司);DAPI染色液(碧云天公司);D-Hank液等自行配置。

1.1.3 实验仪器 ZHJH-C1112B超净工作台(上海智城公司);SMART Cell CO2培养箱(Heal Force公司);C-MAG HS7恒温磁力搅拌器(IKA公司);XDS-1B光学显微镜(IC公司);Nikon ECLIPSE 80i免疫荧光显微镜(新飞达光学仪器公司);离心机、离心管、吸管、眼科剪、眼科镊等由本实验室提供。

1.2 实验方法

1.2.1 组织消化和细胞分离 配制0.1%胰酶DHank缓冲液，过滤除菌备用;恒温磁力搅拌器预热至35～37℃、转速80～100 r/min;取出生1～3日龄健康新生SD大鼠，无菌条件下眼科剪剪取乳鼠心室，置于D-Hank缓冲液中清洗并剔除心脏上的结缔组织及血块，再用D-Hank缓冲液清洗1次，去除血细胞;将漂洗后的心肌组织在少量D-Hank缓冲液中用眼科剪剪成约1 mm3的小块，转移至100 ml无菌锥形瓶中，静止1 min弃上清液，然后加入10 ml 0.1%的胰酶，吸管将心肌组织打散，放入搅拌子，37℃水浴中磁力搅拌器分次消化。首次与第2次消化10 min后的消化液丢弃(主要含红细胞);重新加入0.1%胰酶15 ml，消化15 min，随后收集每次消化的细胞悬液，收集的细胞悬液应及时采用含有10%胎牛血清的培养基终止胰蛋白酶的作用。重复上述消化、收集细胞、终止消化等步骤6～7次，直至组织变白。

1.2.2 心肌细胞纯化和培养 将收集的细胞悬液800 r/min离心5 min，弃上清液，用含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，并将细胞悬液过滤后转移至培养瓶中，置于含5%CO2细胞培养箱中37℃培养1 h后，将未贴壁的细胞悬液转移至另一培养瓶，继续培养1 h后，将未贴壁的细胞悬液转移至离心管中，台盼蓝染色法检测细胞成活率。细胞计数后，用含10%胎牛血清的DMEM培养基将细胞密度调整至3×105/ml，并接种于6孔培养板中，置于含5%CO2细胞培养箱中37℃培养。24 h左右光学显微镜下可见心肌细胞节律性收缩，换液去除未贴壁的细胞悬液，更换新鲜培养基。

1.2.3 台盼蓝染色法检测心肌细胞成活率 取0.5 ml 0.4%台盼蓝染色液、0.3 ml磷酸盐缓冲液(PBS，0.01 mol/L，pH 7.2)和0.2 ml吹打均匀的心肌细胞悬液，充分混匀，混合液放置5～10 min，吸管滴少量混合液入计数板。显微镜下计数活细胞数。正常细胞不被染色，呈透明、折光性强的细胞，细胞死亡后细胞膜通透性增大，台盼蓝进入细胞内，细胞呈蓝色。细胞成活率(%)=(总细胞数－着色细胞数)/总细胞数×100%。

1.2.4 免疫荧光染色法鉴定心肌细胞纯度 取培养48 h已爬片心肌细胞，用PBS轻轻冲洗1次;冷75%乙醇溶液固定15 min，PBS洗3次;加 0.3%Triton X-100通透30 min，PBS洗3次;山羊血清室温封闭60 min;1∶200稀释的兔抗大鼠心肌肌钙蛋白Ⅰ多克隆抗体(1∶50稀释的小鼠抗大鼠α-Sarcomeric actin单克隆抗体)于4℃过夜(阴性对照用PBS代替)，PBS洗3次;l∶100稀释的山羊抗兔IgG抗体(1∶50稀释的山羊抗小鼠IgG)孵育1 h;加DAPI染色液孵育10 min，PBS洗3次;抗荧光淬灭液封片后立即倒置荧光显微镜下观察，每个盖玻片随机选择8个视野，拍照后分析心肌细胞纯度。

2 结果

2.1 心肌细胞形态学观察 普通光学显微镜观察显示，刚分离的心肌细胞呈圆形，培养3～5 h细胞开始贴壁生长，呈圆形，后变为梭形，细胞逐渐展开，伸出伪足，变为多边形、不规则等形态;24 h后细胞基本贴壁，多数贴壁的单个细胞出现自发性搏动，搏动频率和节律不同，细胞生长密度可达到板底的80%;48 h后伸出伪足相互接触交织成网，搏动趋于同步性;72 h后会逐渐形成细胞簇并出现同步搏动，形成功能性合胞体细胞，见图1。

2.2 心肌细胞成活率检测 台盼蓝染色可见分离细胞成活率达90%以上。

2.3 心肌细胞纯度鉴定 培养48 h的心肌细胞经肌钙蛋白Ⅰ多克隆抗体、α-Sarcomeric actin单克隆抗体免疫荧光染色后，于倒置荧光显微镜下观察可见肌钙蛋白Ⅰ多克隆抗体(绿色荧光，位于细胞质)表达阳性率达98%以上，α-Sarcomeric actin单克隆抗体(绿色荧光，位于细胞质)表达阳性率达98%以上，见图1，DAPI染色的细胞核呈蓝色荧光，而阴性对照无荧光呈现。

图1 原代培养的新生SD大鼠心肌细胞 ×400

3 讨论

新生大鼠心肌细胞分离以往常采用胰蛋白酶联合胶原酶消化法进行分离［1－2］，但该研究经多次实验发现单用0.1%胰蛋白酶(不含EDTA)消化分离细胞，避免用胶原酶消化对心肌细胞造成损伤，使分离细胞的存活率高达90%，同时降低了实验成本。采用恒温磁力搅拌器分次消化细胞，转速80～100 r/min，温度35～36℃，避免既往用吸管反复吹打消化法对心肌细胞造成的机械损伤，提高消化效率，缩短消化时间，降低细胞膜受损程度，提高细胞获得率及存活率。采用两次差速贴壁法纯化心肌细胞，心肌细胞纯化方法有差速贴壁法［3］和化学试剂抑制法［4］，差速贴壁法是根据心肌细胞和成纤维细胞在培养器皿表面贴壁生长的速度不同而纯化心肌细胞，其对心肌细胞无损伤;化学试剂抑制法是利用特定的化学物质抑制生长活跃的成纤维细胞增殖，即在培养基中加入有丝分裂抑制剂如阿糖胞苷、5-溴脱氧尿苷等抑制心肌成纤维细胞DNA合成或蛋白质合成，但有文献［4］报道认为其对心肌细胞有损伤;两次差速贴壁后培养48 h，经肌钙蛋白Ⅰ多克隆抗体和α-Sarcomeric actin单克隆抗体鉴定，心肌细胞的纯度高达98%，在不损伤和影响心肌细胞生长的同时，也提高了心肌细胞纯度。细胞接种密度控制在2.5 ×105～5 ×105/ml［5］，培养 24 h 后细胞生长密度可达到板底的80%，避免细胞接种过多发生营养不良或细胞接种过少导致心肌细胞间无法进行信息交流。此外，取材过程严格无菌操作、移取心脏迅速、熟练掌握实验操作流程等缩短心肌细胞缺氧缺血时间，提高了细胞的存活率。

［1］Golden H B，Gollapudi D，Gerilechaogetu F，et al.Isolation of cardiac myocytes and fibroblasts from neonatal rat pups［J］.Methods Mol Biol，2012，843:205 －14.

［2］张乃菊，陈天平，祝晓光.乳鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞的原代培养［J］.蚌埠医学院学报，2010，35(6):558－61.

［3］Zhang Z Y，Liu X H，Hu W C，et al.The calcineurin－myocyte enhancer factor 2c pathway mediates cardiac hypertrophy induced by endoplasmic reticulum stress in neonatal rat cardiomyocytes［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2010，298(5):H1499 －509.

［4］Wu L X，Gu X F，Zhu Y C，et al.Protective effects of novel single compound，Hirsutine on hypoxic neonatal rat cardiomyocytes［J］.Eur J Pharmacol，2011，650(1):290 － 7.

［5］Prasad A M，Inesi G.Analysis of Calcium transients in cardiac myocytes and assessment of the sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase contribution［J］.Methods Mol Biol，2012，798:411 －21.