糖化血红蛋白检测方法与标准化

刘德军，彭旭东，王伟夫

（1.解放军医学院，北京 100853；2解放军总参谋部警卫局保健处）

糖化血红蛋白检测方法与标准化

刘德军1，彭旭东2，王伟夫2

（1.解放军医学院，北京 100853；2解放军总参谋部警卫局保健处）

近年来，糖尿病（DM）的发病率呈不断上升的趋势，已成为威胁人民群众健康的第三大慢病。中国20岁以上成年人的DM发病率已达到9.7%［1］，早期发现DM和血糖水平的控制显得非常重要。空腹血糖、餐后血糖和葡萄糖耐量试验（OGTT）是国际上公认的诊断DM的标准，但其只能反映瞬时血糖水平，容易受到各种因素的影响，糖化血红蛋白（GHb）因其生物学特性，能够反映最近2～3个月内的平均血糖水平［2］，且不受空腹和胰岛素治疗的影响，因此它作为一个血糖监测的重要指标在临床上得到广泛应用。2010年美国糖尿病协会（ADA）在《2010年糖尿病诊疗指南》中正式将糖化血红蛋白（HbA1c）纳入DM的诊断标准［3］，现就GHb的临床检测方法与标准化作一综述。

1 GHb的生化特性

GHb是指人体血液中结合了任何形式碳水化合物的血红蛋白（Hb）。人类Hb可分为HbA（95%～97%）、HbA2（＜3%）、HbF（＜l%）。HbA中未结合糖类的为HbA0（90%）、结合糖的为HbAl（5%～7%）即GHb。HbA1c又可分为和HbA1a1、HbA1a2、HbA1b和HbAlc，HbAlc占GHb的70%～90%，其分子结构稳定，组织中由葡萄糖的游离醛基与HbA的β链N末端缬氨酸进行不可逆的非酶促反应，称为糖基化，GHb的形成主要取决于血糖浓度及血糖与Hb的接触时间［2，4］，临床上所测定的糖化血红蛋白主要指HbAlc。

2 HbA1c检测方法

HbA1c的检测方法按其理化性质可分为两大类：一类是基于糖化与非糖化Hb所带电荷不同，如离子交换层析法、电泳法；另一类是基于Hb上糖化基团的结构特点，如亲和层析法、免疫法和酶法［5-6］。不同检测方法的结果存在差别，而糖尿病的诊断与血糖监测要求测定值不受检测方法的影响，因此不同检测方法结果的可比性和标准化非常重要［7］。

2.1 离子交换层析法 主要有高效液相色谱法（HPLC），低效液相色谱法（LPLC）和手工微柱，广泛采用的是HPLC。此方法是基于血红蛋白β链N末端缬氨酸糖化后所带电荷不同而建立，应用弱酸性阳离子交换树脂，HbAlc由于所带正电荷相对较少，在选定的低浓度洗脱液和接近中性的pH条件下，HbAlc首先被洗脱，从而与HbAla、HbAlb、HbF、不明蛋白组分、蛋白组分3、不稳定GHb及HbS等分离［8］。所得到的的层析谱横坐标是时间，纵坐标是百分比。HbAlc的值以HbA1c峰面积占Hb总面积的百分比来表示。此方法测定的HbAlc结果精确，准确性和重复性高。美国临床化学协会（AACC）、糖化血红蛋白标准化分会和国际临床化学和实验室医学联盟（IFCC）HbAlc标准化工作组建议，将HPLC方法作为检测HbA1c的金标准［9］。虽然HPLC方法具有精度高、重复性好、操作简单等优点，但其易受HbA1c前体、甲酰化或乙酰化Hb、胎儿血红蛋白（HbF）及变异血红蛋白（HbS、HbE、HbC、HbD）的干扰，并受外界环境温度的影响。在某些疾病情况下（如贫血、白血病、珠蛋白生成障碍性贫血、遗传性胎儿血红蛋白持续症）HbF会异常升高，从而使结果产生偏差［10］。

2.2 电泳法 电泳法是基于糖化和非糖化Hb所带电荷不同，于酸性缓冲液条件下（pH6.0）在琼脂糖凝胶上泳动速度不同进行分离检测。电泳结束后，Hb各组分从负极到正极分别是HbA1a、HbA1b、HbAlc、HbA0，通过吸光度扫描，可计算得出HbA1c的百分含量。Doelman等［11］采用毛细管电泳法测定HbA1c，其结果不受氨基甲酰化以及乙酰Hb变异体的影响，其他Hb变异体（HbS、HbE、HbC、HbD）也不干扰本方法的准确性。该方法的缺点是速度较慢，自动化程度低，所测结果与实验员对电泳波峰的判断有关，且设备费用昂贵，目前主要用于GHb的研究。

2.3 亲和层析法 亲和层析法利用硼酸盐与整合在Hb上的葡萄糖顺位二醇基可逆结合的特性，由Mallia等［12］于1981年研发的。通常使用间-氨基苯硼酸琼脂糖，将血样本加到层析柱后，所有的GHb与硼酸结合留在柱中，非GHb直接被洗出层析柱；再加入高浓度也包含顺位二醇基的多羟基复合物（如山梨醇），GHb与硼酸的结合被山梨醇替换并被洗脱下来，分别测量两组分，并计算比值。该方法具有操作简单、快速、准确、精度较高且不受Hb变异体影响等优点［9］。该方法目前可以标准化，且与HPLC有良好的相关性，比较适用于临床监测。

2.4 免疫法 免疫法利用抗原-抗体特异性反应原理，将HbA1c的β链N末端最初的4～8个氨基酸作为抗体识别位点，制备相应的单克隆抗体，血样本中的HbA1c与相应的单克隆抗体发生凝集反应，通过比色或比浊法测定HbA1c的含量。测定完HbA1c的含量后还需检测Hb总量，从而计算出HbA1c的百分比。该方法快速、准确、特异性强、重复性好，可在全自动生化仪上测定，不用另外购置仪器。近来发现变异血红蛋白可影响检测结果，且此方法受高血糖、三酰甘油、胆红素的干扰。此外，在高浓度样本的检测中结果偏低，与抗体浓度不能达到相应高度有关。

2.5 酶法 血样本经溶血处理后，由蛋白酶消化处理，糖基化的缬氨酸被释放出来，作为果糖基缬氨酸氧化酶的底物，被氧化产生H2O2。H2O2的浓度与血样本中HbAlc的含量成正比，在过氧化物酶催化下，与特定的色原耦联，根据颜色变化程度可得H2O2的浓度，从而计算出HbAlc的含量，同时测定总Hb的浓度，计算HbAlc与Hb的浓度比值，得出HbA1c的百分比［13］。酶法检测HbAlc可应用于自动生化分析仪，具有操作简便、准确、快速、重复性好，特异性高等特点。检测中处理后的血样本与氧化还原剂反应，减少了小分子和高分子物质的干扰［14］。与作为金标准的HPLC法相比，测定结果具有良好的相关性［13］。

3 HbA1c检测的标准化

实验室中常用的HbAlc检测方法因所用原理不同，加上各种因素的影响，使测定结果的准确性、重复性、稳定性都有所差异，导致各实验室之间的结果缺乏可比性，对HbA1c在临床上的应用制造了障碍。

为解决HbA1c检测结果可比性的问题，1984年Peterson等［15］首次提出检测结果的标准化问题，对实验室间各种方法的可比性和重复性进行了评估。1995年国际临床化学协会（IFCC）成立了HbAlc标准化工作组，并于2002年发表了HbAlc的参考检测体系［16］。新的参考体系形成了一个国际化的标准，2007年5月由美国糖尿病协会、欧洲糖尿病研究协会、国际糖尿病联合会和IFCC提出共同协议，将在世界范围内形成HbAlc检测结果的标准化，并采用IFCC单位（mmol／mol）和美国国家糖化血红蛋白标准化计划（NGSP）单位（%）共同报告HbAlc结果［17］。

我国HbAlc测定标准化工作还处于起步阶段。虽然早在2010年ADA已正式将HbAlc纳入糖尿病的诊断标准，但我国的指南却迟迟未将HbAlc写入指南，主要还是由于我国很多地区HbAlc检测尚不普遍，不同实验室之间的结果缺乏可比性。王冬环等［18］的研究显示，同一方法在不同实验室间的变异系数在10%甚至20%以上，距离国际标准5%还有很大差距，使得HbA1在我国应用于糖尿病的筛查、诊断、监测上的效果大打折扣。我国为糖尿病大国，糖尿病患患者数已达9200万，居世界首位，同时还有糖尿病前期患者1.48亿［1］。为提高我国糖尿病患者的筛查、诊断、监测和治疗水平，尽早与国际接轨，建立起全国性的HbAlc检测的标准化是摆在我们医务工作者面前的一项重要工作。

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［17］Consensus Committee.Consensus statement on tlle world wide standardization of the hemogiobin aicmeasurement：the american diabetes association，european association for the study of diabetes，international federation of clinical chemistry and labora ory medicine，and the international diabetes federation［J］.Diabetes Care，2007，30（9）：2399-2400.

［18］王冬环，张传宝，陈文祥，等.应重视糖化血红蛋白测定技术及量值溯源［J］.中华检验医学杂志，2008，31（9）：965-968.

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10.3969／J.issn.1672-6790.2014.06.041

2014-08-11）

刘德军，主任医师，Email：liudejun6721＠126.com