不同采收期老翘中化学成分含量测定

王进明，范圣此，赵艳，陈婷婷，孙斌，杨霞

（山西振东道地药材开发有限公司，山西长治047100）

老翘为木犀科植物连翘 [Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl]的干燥果实，果实熟透时采收，晒干，除去杂质，习称“老翘”[1]。连翘为常用大宗药材品种以及被列为国家重点保护野生药材物种，其化学成分复杂多样，其中主要是苯乙醇及其苷（连翘酚、连翘苷及连翘酯苷 A、B、C、D、E 等）、木质素类（2，3-二苄基丁内酯型木脂素、辛烷型木脂素等）、黄酮类（槲皮素、芦丁、异槲皮素等）、五环三萜类（白桦酯酸、齐墩果酸、熊果酸等）、生物碱（物碱suspensineA（1）、（-）-7′-O-methylege 等）及挥发油[2]等。连翘具有清热解毒，消肿散结，疏散风热之功效[3-5]，也是预防和治疗非典型性肺炎、禽流感、甲型H1N1流感等流行性疾病的主要成分。虽然以前的一些研究学者对老翘中连翘苷、连翘酯苷A的含量也有些研究，但是他们的研究未明确定义老翘样品采集时间与取样方式（如市场购买、山上采集等）等，也没有对老翘在某个时期内的含量变化进行整体研究比较；此外，老翘的采收期延迟或提前、采收标准不一，导致老翘品质也无法界定，而这些现象在出现如流感等流行性疾病导致老翘价格攀升的年份则尤为严重，老翘采收期和采收标准的不确定造成其品质差异较大，这必然导致以老翘为原料的中成药投料受到影响，进而影响到中成药制剂的疗效。该研究比较了不同采收期老翘果实中连翘酯苷A、连翘苷及浸出物的含量，旨在为中药老翘的质量控制和老翘适宜采收期的确定提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试老翘。老翘样品于2012年10月10日开始采集于山西振东集团定植的36株连翘植株，至2013年3月15日结束合计采集11次样品，每次采集样品的时间间隔为10 d，并且以固定的每12株为一个混合试验样品。连翘植株经山西大学张立伟教授鉴定为木犀科植物连翘 [Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl]。

1.1.2 仪器与试剂。Aglient1260高效液相色谱仪（四元泵，紫外检测器，在线脱气机，柱温箱）；BSA124S电子天平（赛多利斯科学仪器）；KQ-500DB型数控超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；HY-3A多功能调速振荡器（江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）；FW80高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

试验用水为双蒸水，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯；连翘苷对照品（批号：110821-201112，含量为96.8%）、连翘酯苷A对照品（批号：111810-201103，含量为92.9%），供含量测定用，均购自中国药品生物制品检定所。

1.2 方法

1.2.1 条件。色谱柱为Luna5uC18（2）100A（250 mm×4.6 mm，5 μm），连翘苷测定流动相为乙腈-水（25∶75，V∶V），检测波长为 277 nm，柱温为室温，流速为1.0 mL/min；连翘酯苷A测定流动相为乙腈-0.4%冰醋酸溶液（15∶85，V∶V），检测波长为 330 nm，柱温为室温，流速为1.0 mL/min。HY-3A多功能调速振荡器频率为125 Hz。

1.2.2 对照品溶液的制备。精密称取连翘苷对照品11.47 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；精密称取连翘酯苷A对照14.97 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（临用配制）。

1.2.3 供试品溶液的制备。连翘苷供试品溶液制备：取老翘不同采收期样品粉末（过三号筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇15 mL，称定重量，浸渍过夜，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）25 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL，蒸至近干，加中性氧化铝0.5 g拌匀，转移至中性氧化铝柱（100～120 目，1 g，内径为 1.0～1.5 cm）上，用 70%乙醇 80 mL洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用50%甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

连翘酯苷A供试品溶液制备：取老翘不同采收期样品粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇15 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率 250 W，频率 40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.2.4 线性关系考察。分别精密量取浓度为1.110 30 mg/mL的连翘苷、1.390 71 mg/mL连翘酯苷A对照品溶液 3、5、8、10、12、15 μL 进样分析，测定峰面积。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得连翘苷回归方程为（y=2219.4x+591.86，R2=0.9997），表明连翘苷进样量在3.33～13.32 μg具有良好的线性关系；连翘酯苷A回归方程为（y=1 771x+599.59，R2=0.999 7），线性范围在 4.17～6.69 μg具有良好的线性关系。

1.2.5 精密度试验。精密吸取对照品溶液10 μL，重复进样5次，连翘苷峰面积的RSD为0.8%，连翘酯苷A峰面积的RSD为0.1%，表明该方法的精密度良好。

1.2.6 重复性试验。取供试品（同一批号），按供试品溶液的制备方法制备6份供试液，分别进样10 μL，连翘苷的RSD结果为1.6%，连翘酯苷A的RSD结果为0.3%。

1.2.7 稳定性试验。精密吸取同一种供试品溶液在0、4、6、8、10、12 h 内重复进样 6 次，每次 10 μL，计算连翘苷峰面积的RSD值为1.5%，连翘酯苷A的峰面积为0.2%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

1.2.8 加样回收率试验。取已测含量的供试品溶液5份，分别精密加入定量的连翘苷、连翘酯苷A对照品，依法测定其结果见表1～2。

表1 连翘苷加样回收率试验结果

表2 连翘酯苷A加样回收率试验结果

1.2.9 样品测定。取需要测定供试品，按照第“1.2.3”项方法制备供试品溶液，依法测定，以外标法计算测定结果。

2 结果与分析

2.1 不同采收期老翘中连翘酯苷A测定结果

由表3可以看出，老翘中连翘酯苷A的含量在2012年10月10日采集的样品中最高，为2.44%，2013年2月25日的样品最低，为0.16%，同时在2012年12月30日以前的样品中连翘酯苷A的含量都达到了中华人民共和国2010版药典标准0.25%的规定，在以后的几个样品测定结果中，连翘酯苷A的含量则达不到药典的标准。从整个采集老翘样品中连翘酯苷A含量的测定结果来看，其含量呈现不断下降的趋势。

表3 不同采收期老翘中连翘酯苷A、连翘酯苷及浸出物含量%

2.2 不同采收期老翘中连翘苷测定结果

由表3可以看出，连翘苷从老翘样品采集开始到采集结束的测定结果中均达不到2010版中华人民共和国药典不得低于0.15%标准的规定，这与侯莉等[9]采用RP-HPLC法测定不同来源连翘药材中连翘苷的含量试验结果中连翘苷含量普遍低于2000版药典规定的0.15%结果相一致。在该试验测定结果中连翘苷含量最高的仅为0.108%，最低的为0.039%，同时在整个老翘采收样品试验测定结果中，虽然2012年11月—2013年1月的几个样品中连翘苷含量测定趋于平稳，但是从整体试验测定结果的趋势上看，老翘中连翘苷则呈现不断下降的趋势。

2.3 不同采收期老翘中浸出物测定结果

由表3可以看出，老翘采收样品中浸出物的测定结果在2013年1月20日之前采收均达到了2010版中华人民共和国药典规定不得少于16%的规定，浸出物含量最高的为2012年10月10日采收的25.32%，最低的为2013年2月25日采收的样品，为15.63%，而且从整个老翘采集样品测定结果中可看出浸出物的含量变化与连翘苷、连翘酯苷A同样呈现不断下降的趋势。

3 结论与讨论

老翘为连翘果实熟透时采收、晒干、除去杂质的产品。而长期以来无论是研究学者还是连翘主产区采收时间与农忙季节的冲突，在老翘采收的时间上都没有明确的研究结果或标准规定，有些产地老百姓在老翘的采收时间上从每年的10月份以后持续到第2年的连翘开花之前，而这种现象特别是在遇到流感年份导致老翘价格大幅上涨时尤为突出，同时老百姓经常会将往年不能及时采集、漏采的老翘以及多年由于价格影响没有出售的老翘掺入新老翘中出售，其中不乏有些百姓遇到高价格年份时掺入连翘枝条出售，而以上这些现象直接导致老翘品质没有一个统一的考察标准，老翘质量混乱，从而影响到以老翘为原料的中成药疗效，因此，对老翘的采收期和品质标准等研究迫在眉睫[6]。

（1）从以上所有老翘样品中连翘苷、连翘酯苷A、浸出物3种成分含量的测定结果看，连翘酯苷A与浸出物2种成分在某一个时期内均达到了2010版中华人民共和国药典的标准规定，而连翘苷却在整个采收试验含量测定结果中始终没有达到药典的标准规定，这表明对老翘的品质进行评价时，连翘苷也许已经不能作为老翘品质的一个重要质控指标，同时需对正在修订的2015版中华人民共和国药典中老翘的品质评价进行重新修订。连翘酯苷A不但是从连翘属植物中发现的抗菌活性最强的成分之一，同时也是连翘的主要特征性成分[7-8]，在评价连翘及以抗菌为主要功效的制剂质量时发现连翘酯苷A优于连翘苷，因此建议在对老翘进行品质评价和质控时应以连翘酯苷A和浸出物2种评价指标为主进行评价，或采用多指标成分进行老翘质量的评价更为合适[9]。

（2）从该试验结果看，老翘中的连翘苷含量在整个采收期的试验结果中均没有达到2010版药典的规定，如果仅从老翘中连翘酯苷A和浸出物含量这2个指标来考察老翘的品质，则老翘的采收期应该为每年的10月—11月下旬，但在此时期内百姓由于受秋季农作物收获的影响，延迟老翘的采收期，同时也会因延长采收期而给上山采摘人员带来一定的危险。

（3）在笔者试验期间常出现降雨、降雪等现象，而该期的老翘也将要开裂或已开裂，这种现象是否为雨水对老翘内部的浸透提供了便利，从而影响到老翘中连翘苷、连翘酯苷A、浸出物3种成分含量的降低，以及这3种成分的含量测定结果在后期出现不同程度的升高后又降低是否与降雪有关，仍需进一步的研究确定。

[1]国家药典委员会.中国药典，I部[S].北京：化学工业出版社，2010：234.

[2]李晓燕.中药连翘抗菌活性的考察[J].山东医药工业，1997，16（2）：46.

[3]段文娟，耿岩玲，祝贺，等.中药连翘化学成分和分析方法的研究进展[J].山东科学，2010，4（23）：2.

[4]张鸿祺.金银花，桂枝，香薷，连翘，芦根，麦冬解热作用的实验报告[J].山东医刊，1960（10）：22.

[5]山西医学院肝病研究组.甘草，柴胡，连翘对实验性肝损伤的作用[J].新医药杂志，1973（9）：21.

[6]李卫健，李先恩.连翘果实干物质与有效成分积累规律研究[J].中草药，2006，37（6）：921-924.

[7]匡海学，张宁，陆志博.青连翘抗菌活性成分的研究[J].中药通报，1988，13（7）：32.

[8]胡克杰，徐凯建.连翘酯苷体外抗病毒作用的实验研究[J].中国中医药研.究，2001，8（2）：89.

[9]侯莉，王强，任晋斌.RP-HPLC法测定不同来源连翘药材中连翘苷的含量[J].现代中药研究与实践，2005，19（1）：48-49.