胰岛素对葡萄糖转蛋白4转运调节的研究进展

江 雷 龚 剑 江 波

(安徽建筑大学，安徽 合肥 230022)

葡萄糖转运蛋白(GLUT)4是葡萄糖转运蛋白家族的一员，主要分布在骨骼肌细胞和脂肪细胞，在胰岛素刺激或肌肉收缩运动时，促进细胞摄取葡萄糖。在GLUT家族中，只有GLUT4参与骨骼肌细胞和脂肪细胞的GLUT循环。在静息状态下，GLUT4迅速转向细胞内，而且向细胞膜的再转运过程很缓慢。由于细胞对GLUT4缓慢的胞吐作用和快速的内吞作用，超过90%的GLUT4在细胞内，只有4%～10%在细胞膜上。GLUT4在静息状态下积聚在细胞内囊泡膜上，这些囊泡包括反式高尔基网(TGN)、再循环内体(RE)、不同的管囊状小体。GLUT4对胰岛素作用反应敏感，表现为在细胞膜上含量迅速增加，在细胞内含量迅速下降。脂酰肌醇3-激酶(PI 3-kinase)IAⅢ型在GLUT4的转运过程中起重要作用。在少量鸟昔三磷酸(GTP)酶的作用下，PI 3-kinase→非典型蛋白激酶PKC和→Aκt/PKB →AS160是GLUT4向细胞膜转运的主要调节通路。近10年，对GLUT4转运信号调节的研究取得较大进展。本文就Akt/PKB下游事件，含GLUT4囊泡的来源，GLUT4在细胞膜上募集、锚定、融合等方面的研究进展进行综述。

1 用于研究GLUT4转运的细胞模型

很多对于GLUT4转运途径的认识和研究是通过对肌肉和脂肪细胞系的研究得来的。这些细胞系与成熟细胞很相似，但又不完全相同。3T3-L1脂肪细胞被认为是较好的模型而广泛运用。3T3-L1脂肪细胞在接受胰岛素刺激后，对葡萄糖的摄取比基础水平提高10倍，而分离出来的大鼠脂肪细胞提高20倍，人的脂肪细胞则只提高2～3倍。在3T3-L1脂肪细胞，GLUT4主要储存在细胞核周围的囊泡膜上，在细胞质其他部位的囊泡含量很少。有研究表明，细胞中存在特定的含GLUT4小室，受胰岛素调节，在最后的与细胞膜融合过程中需要突出小泡膜蛋白(VAMP)2存在并发挥作用。这些小室被命名为专门小室(SC)和GLUT4储存囊泡(GSV)〔1〕。胰岛素既能促进GLUT4从RE向SC/GSV转运，又能促进GLUT4从SC/GSV向细胞膜转运〔2〕。在成熟的脂肪细胞和肌细胞，GLUT4能较长时间保持活性(半衰期大约40 h)，所以每一个多肽链在其活性状态可以多次循环到细胞膜上。

肌肉和脂肪细胞受到胰岛素刺激后，GLUT4胞吐速率迅速增加，内吞作用少量减少，10～15 min细胞膜上的GLUT4即可达到峰值。胰岛素受体1磷酸化， PI 3-kinase、PKC、Akt/PKB的活性提高也参与调节。包括Cbl-CAP-APS-Crk Ⅱ-C3G-TC10序列的PI3激酶信号因子促进脂肪细胞膜获得GLUT4，而对肌肉细胞没有作用。在肌肉细胞，PI3激酶促进表层肌动蛋白重建，不受Akt约束。重建的表层肌动蛋白可能参与“热点”的产生，所以对细胞膜获得GLUT4有关键作用。“热点”是胰岛素信号因子作用于细胞以及囊泡与细胞膜融合的位置。

2 胰岛素对GLUT4储存和胞吐作用的调节

目前一致公认，细胞膜依靠胰岛素获得GLUT4需要IA家族PI3激酶。但是PI3激酶是否参与GLUT4在小室的储存、 GLUT4向细胞膜转运的动员、转运体的内吞，直到最近才有所了解。Foster等〔3〕研究表明，GLUT4在内体间快速转运需要PI3激酶的活化。Yang等〔4〕研究表明，细胞膜上的PI3激酶对转运体胞吐的作用比内吞作用更明显。IA家族PI3激酶受胰岛素刺激后,生成磷酸肌醇PI(3,4,5)P3。PI(3,4,5)P3通过载体进入脂肪细胞或肌肉细胞，能提高GLUT4向细胞膜的动员〔5〕。

磷酸肌醇信号可能是通过PDK1及其下游分子PKB、PKCζ/λ传导。运用失活突变型、特定的基因敲除或基因沉默技术，表明这些酶在胰岛素诱导的细胞膜获得GLUT4的过程中都起作用〔6〕。PKCλ与胞外分泌有关，与驱动蛋白KIF3B结合的Rab4酶突变失活，则这一作用被抑制。Rab4酶被认为调节GLUT4通过微管向细胞膜动员。

Akt/PKB与GLUT4循环的多个步骤有关。Akt/PKB进入细胞内小室的证据包括：①在胰岛素作用下，Akt/PKB向含GLUT4的内膜转移〔7〕；②在Akt/PKB表达缺陷的细胞中，阻止了GLUT4在内体间的快速转运〔8〕；③有活性的Akt/PKB作用于含GLUT4的小室， GLUT4嵌合体与Akt/PKB融合〔8〕，IRAP(SC/GSV的替代运输蛋白)与细胞膜融合〔9〕；④在Akt/PKB表达缺陷的3T3-L1脂肪细胞，阻止胰岛素促使的GLUT4易位〔9〕，在大鼠脂肪细胞无此现象〔8〕。AS160是Akt/PKB的底物。突变的AS160被称为AS160-4P，Akt/PKB与它作用相对应的4个靶点发生变异。AS160-4P可抑制胰岛素诱导的细胞膜GLUT4增加〔10〕。运用全内反射荧光显微技术，用绿色荧光蛋白(GFP)标记GLUT4，形成 GFP-GLUT4。在表达AS160-4P的细胞，在膜周围没有发现胰岛素刺激引起的来自RE的GFP-GLUT4和含GFP-GLUT4的囊泡〔10〕。这些结论表明，AS160可能参与了胰岛素诱导的GLUT4从SC/GSV的外流，而AS160-4P阻止GLUT4的外流。最近，在免疫纯化的含GLUT4的小室(包括SC/GSV，可能还有其他的含GLUT4的囊泡)，AS160有3个可能的Rab靶点(Rab 2A，8A，14)被发现〔11〕。进一步研究揭示Rabs和其靶点，在从胰岛素受体到胰岛素敏感的含GLUT4的小室之间的信号通路中可能起作用。Rab11调节膜蛋白从内体向膜和从内体向(TGN)的转运。Rab11拮抗肽的表达阻止GLUT4从富含TfR的小室分离，说明其可能与GLUT4在内体小室间的转运有关〔12〕。

3 胰岛素对GLUT4入胞作用的调节

入胞作用包括入胞的起始阶段和经入胞途经对内吞蛋白的转运。GLUT4的入胞主要经由网格蛋白小窝。GLUT4通过与接头蛋白2的μ2亚单位的相互作用，在GTP酶发动蛋白的帮助下，使含GLUT4囊泡从膜上分离。陷窝蛋白(caveolin)对GLUT4入胞也起作用。与肌动蛋白微丝共定位的EH结构域绑定蛋白(EHD)2和它的伴侣EHD2-结合蛋白(EHBP)1与GLUT4的入胞有关。它们的基因沉默减少GLUT4的入胞〔12〕。然而，因为网格蛋白和它关联的适配蛋白与EHBP1作用于不同的蛋白入胞过程，GLUT4的入胞机制还需要进一步研究。

胰岛素降低GLUT4的入胞速率，通过内吞囊泡加速其转运〔3〕。胰岛素延缓GLUT4入胞的信号通路仍然需要研究。过度表达AS160-4P轻微增加膜上GLUT4的入胞作用，说明AS160在这一过程中可能起作用〔10〕。初生的入胞小泡迅速(2 min内)转运到早期内体(EE)，再到RE。胰岛素降低存在于EE的GTP酶 Rab5的活性；在PI3激酶存在的情况下，也降低马达动力蛋白与微管相互作用。这些事件延缓了GLUT4从细胞膜到EE的进程。随后，胰岛素加速GLUT4通过RE向SC/GSV的转运，而且这一过程与IA家族PI3激酶和Akt/PKB有关〔3〕。含GLUT4内体的转运可能还有PI5激酶PIKfyve的参与。虽然PI5激酶PIKfyve能被Akt/PKB磷酸化，但是，胰岛素对其活性的影响还需要进一步研究。

4 胰岛素对含GLUT4囊泡与细胞膜融合的调节

除了上述IA家族PI3激酶参与含GLUT4内体的转运，近来有报道，抑制这些酶的活性，仍然在细胞内周缘获得大量没有完成对膜插入的GLUT4。这一现象可能是因为GLUT4在内体同时存在不同的抗原决定部位。在成肌细胞和脂肪细胞，100 nmol/L渥曼青霉素可以抑制IA家族PI3激酶活性，同时却出现胰岛素诱导的GLUT4在细胞膜周围大量堆积〔13〕。但是这些GLUT4第一胞外环结构被改变，阻止细胞外周myc或HA抗原决定簇对其识别。经渥曼青霉素和胰岛素预处理后的细胞，用电子显微镜也能看到含GLUT4的囊泡停留在细胞膜〔13〕。由于无论细胞是否受胰岛素刺激，都没有观察到含GLUT4囊泡与细胞膜融合，这一结果表明含GLUT4囊泡与细胞膜融合需要IA 家族PI3激酶。在L6肌细胞，载体传递PI3激酶的主要产物PI(3,4,5)P3，引起含GLUT4囊泡与细胞膜融合〔5〕；PI3激酶下游蛋白激酶Akt/PKB的活性随温度从19℃到37℃变化而变化〔14〕，含GLUT4囊泡与细胞膜的融合现象也随之发生变化。此外，另一个PI3激酶效应器——PKC，通过与80K-H和Munc18c的复杂作用，提高VAMP2绑定在突触前膜上的蛋白syntaxin4，完成对融合事件的调节。siRNA降低磷脂酶D1表达，发现磷脂酶D1也调节含GLUT4囊泡与细胞膜的融合〔15〕。总而言之，PI3激酶IA和亚型相关蛋白与胰岛素引发的含GLUT4囊泡与细胞膜的融合有关。

囊泡与膜的融合受(SNARE)蛋白调节。胰岛素刺激引发细胞膜获得GLUT4的过程可被SNAREs (VAMP)2(a v-SNARE)，syntaxin4和SNAP23(two t-SNAREs)阻止〔16〕。v-SNAREs VAMP3 或 VAMP7 没有阻止这一过程〔1〕。有趣的是，VAMP2的干扰不会改变未受刺激静息状态下的细胞膜GLUT4水平。因为在免疫纯化的GLUT4小室(可能是SC/GSV)发现VAMP2，说明持续再循环的GLUT4囊泡和胰岛素动员的GLUT4囊泡可能有不同的v-SNARE补体促进其在细胞膜的锚定和融合。

最近运用全内荧光反射技术研究大鼠脂肪细胞发现，在距离细胞膜100 nmol/L以内，胰岛素可能通过锚定事件减缓GLUT4-GFP的移动。这些结论表明，在基础状态，GLUT4囊泡到达细胞膜，但是并没有锚定。锚定/融合是受胰岛素调节的〔17〕。实际上，出胞复合物，特别是Exo70，引导囊泡到与膜融合的精确位置。随后，囊泡上的VAMP2与膜上的t-SNAREs syntaxin4和SNAP23形成SNARE复合物。Munc18c，Synip和Tomosyn与synatxin4绑定，抑制胰岛素诱导的GLUT4与细胞膜融合〔18〕。这些蛋白可能受胰岛素调节，而且Synip就是被At/PKB磷酸化，从而空出syntaxin4的〔18〕。可是， Akt/PKB磷酸化丙氨酸残基，使得适宜的Synip磷酸化被竞争，却没有阻止依赖胰岛素的GLUT4在细胞表面的聚集。虽然如此，出现证据支持源自胰岛素的信号对SNARE复合物能进行有效调节，其机制值得进一步的研究。

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