流感病毒蛋白糖基化及其功能研究进展

丁小满,俞慕华

流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)3型，其中甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)亚型众多，容易发生变异，可感染包括人在内的各种动物像猪、马、禽类、鸟类等，而且多次引起世界性大流行，一直受到人们的关注。本文综述了甲型流感病毒外膜两种重要糖蛋白(HA、NA)糖基化及其功能、研究方法等方面的进展。

1 流感病毒的糖蛋白

甲型流感病毒在病毒分类学上属于正粘病毒科，基因组为分节段的单股、负链RNA。该病毒编码的蛋白质有糖基化和非糖基化之分，其中血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)是糖基化蛋白，都含有N-连接寡糖[1]，也是病毒表面的主要抗原，其余都是非糖基化蛋白。病毒蛋白糖基化在病毒糖蛋白的正确折叠、运输、定位及构象稳定性等方面都发挥着重要作用，同时还参与调节流感病毒与宿主细胞表面糖链受体之间结合能力和特异性的功能[2-3]。

1.1血凝素糖蛋白

1.1.1HA的糖链受体结合特异性 HA是流感病毒最重要的表面糖蛋白，由病毒RNA 片段4 编码，在病毒表面以三聚体的形式存在，包括胞内尾巴、穿膜区、颈部和头部4部分[4]。HA远膜端三聚体球形头部的受体结合位点(receptor binding site，RBS)识别宿主细胞膜上的糖蛋白或糖脂糖链末端的唾液酸(sialic acid，SA)多糖受体并与之相结合是A型流感病毒接触和进入宿主细胞的关键。正常禽类流感病毒受体是α2-3唾液酸半乳糖(SAα2-3Gal)受体，其拓扑构型是圆锥形。人类流感病毒的是α2-6唾液酸半乳糖(SAα2-6Gal)受体，其中短链的SAα2-6Gal受体呈圆锥形，而长链的SAα2-6Gal受体呈伞形，后者扩大了与RBS的结合[5-6]。进一步的研究发现唾液酸多糖受体含有一个五糖结构，其中唾液酸(SA)和相邻的半乳糖两种糖分子构象发生顺时针扭转则为α2-6 连键，形成SAα2-6Gal受体，逆时针扭转则为α2-3 连键，形成SAα2-3Gal受体。说明唾液酸多糖受体的构象变化使病毒HA对其识别的特异性也发生变化[7]。

1.1.2HA的功能及其糖基化对病毒的影响 HA主要在病毒侵染宿主细胞的早期发挥作用：一是HA的受体结合位点(RBS)和宿主细胞膜上的唾液酸(SA)多糖受体结合，从而启动病毒感染过程[8]。二是具有与宿主细胞膜融合的活性，促使病毒进入宿主细胞。三是诱导保护性中和抗体的产生，抑制病毒增殖[9]。

近年来的研究发现HA糖基化位点的增减及位置变化，HA上糖链结构、数量的变化以及受体结合位点(RBS)附近糖链的修饰等不仅对病毒的增殖、毒力产生影响，还可以影响病毒与宿主细胞受体的结合能力等。

甲型流感病毒HA茎部的糖基化位点高度保守，可能是HA维持其功能必需的。不同毒株HA头部的糖基化位点的结构和数量则可以发生变化，可能是导致病毒多样性的一个重要原因[2]。有研究表明，流感病毒HA头部的糖蛋白糖基化位点数在病毒演化过程中具有增加的趋势[1,10]。另外，HA的糖基化可以减少由于宿主先天性防御给病毒带来的生存压力，使病毒逃避宿主的免疫系统，维持病毒的生存。如HA的糖基化变化可以使病毒逃避T细胞的识别，HA头部的N-连接多聚糖能够掩盖或修饰抗体识别的抗原位点[1,11]。国内一些研究者通过构建H5N1禽流感病毒某些糖基化位点的删失模型，发现HA糖基化位点的改变还会影响病毒的增殖，并且在不同细胞中，影响是多样性的[12]。

HA上的糖基化位点及糖链结构对流感病毒的糖链受体特异性和宿主范围也有重要影响。当HA糖链结构复杂程度逐步降低，HA 对宿主糖链受体的特异性也随之降低，但亲和力增强[2,13]。HA上糖基化位点与RBS之间的距离也会影响病毒与宿主细胞受体的结合，HA上的糖基化位点距离RBS越近，这些聚糖影响病毒结合受体的潜力越大[14]。最近研究者们发现H7N9的HA上150-Loop区的T160A突变，可导致一个N-糖基化位点的缺失，减弱了其与SAα2-3Gal受体的结合能力，导致该病毒对人类受体的结合能力增强[15-16]。

HA上糖链数量的变化还会影响病毒毒力。HA裂解位点附近[17]、HA受体结合位点附近糖链的增加会减弱病毒毒力，HA 球形头部附近糖链的增加则会增强病毒毒力。同时糖链结构的复杂程度也会影响病毒毒力[2]。

1.2神经氨酸酶糖蛋白 NA为四聚体，呈蘑菇样，是由病毒RNA片段6编码的Ⅱ型糖蛋白。NA的一级结构包括氨基端胞浆尾，非极性跨膜区、茎部和头部。NA茎部含有丰富的糖，差不多占NA中寡糖的一半，剩下的糖链位于头部的顶端和底部，还有一个寡糖位于亚单位界面处。NA作为甲型流感病毒表面主要的糖蛋白，对病毒的传染性有多方面作用：可以从病毒感染的细胞上去除唾液酸残基，有助于子代病毒颗粒的成熟和释放，防止新生流感病毒聚集；在感染早期帮助病毒移至正确的受体结合位点等[18-19]。

目前国内外在NA糖链结构及糖链功能等方面的研究较少，一般多集中在其糖基化位点的研究。神经氨酸酶可以改变流感病毒血凝素的糖基部分，从而增强一些毒株的毒力[20]。Hulse等[21]发现NA糖蛋白头部附加的糖基化位点是H5N1高致病力的一个影响因素，这是因为NA的糖基化可以保护NA糖蛋白避免宿主蛋白酶的攻击，从而扩大病毒宿主范围，增加病毒毒力。

2 流感病毒糖蛋白的研究方法

关于流感病毒糖蛋白的研究内容主要分为两大类：一是流感病毒糖蛋白结构分析，二是流感病毒糖蛋白糖基化位点分析。常用的方法有芯片技术、质谱法以及一些生物信息学软件分析技术等。

2.1糖芯片技术 糖芯片(glycan chip)是生物芯片的一种，又称糖微阵列(carbohydrate microarray)。糖芯片具有高通量，高敏感性，长期稳定性等特点[22]。基本原理是将多个不同结构的糖分子通过共价或非共价作用固定于芯片上，用预处理的蛋白进行杂交，检测杂交信号，对糖和蛋白质之间的相互作用、发现新的糖结合蛋白、鉴定多糖结构等方面进行分析[23-24]。

近年来在流感病毒的糖蛋白研究方法中应用最多的就是糖芯片技术。如Yang等[25]利用糖芯片分析了流感病毒H7N7 A/Netherlands/219/2003的重组HA，发现HA糖基化位点T125A的缺失降低了RBS与SAα2-3Gal受体的结合能力。Xu等[26]通过糖芯片分析H7N9的血凝素发现HA糖蛋白对人类SAα2-6Gal受体的结合能力比较弱，而对禽类SAα2-3Gal受体有优先的强结合能力。说明目前流行的H7N9在人与人之间的传播效率很低，还未完全适应人类。

2.2凝集素芯片技术 凝集素(lectin)是一种能与糖蛋白糖链特异性结合的蛋白质，相同结构的凝集素可识别相同的糖类，一种凝集素只与含有一种糖分子的受体结合[27]。以凝集素为基础发展起来的分析蛋白质的传统方法主要有亲和层析法、流式细胞术和免疫组化法等[28]。这里介绍的凝集素芯片技术是2005年出现的一种新型的糖链分析技术[29]。

凝集素芯片可以对糖蛋白结构进行快速、高通量、高灵敏度的分析[30]。基本原理:将各种已知聚糖结合特异性的凝集素固定于醛基化、环氧化或经其他方式修饰后的玻璃片基上，再与标记过的生物样品孵育反应，经后续处理后，以检测待检测样品的糖结构。该技术常用于检测一些癌细胞表面糖链的表达[31]。Wang等[32]将凝集素与芯片技术相结合对禽类和人类流感病毒HA上的多糖抗原进行研究，其他学者还利用凝集素芯片技术对克隆表达后的糖蛋白血凝素上糖链结构进行分析[33]。

2.3质谱技术 质谱技术常用于糖基化位点的分析。经典的质谱分析技术首先采用酶法或者化学方法把糖链与肽链分开，再分别在氨基酸序列水平或者糖链水平进行分析。该技术对糖链的糖基化位点分析前，一般先对糖基化位点进行特异的质量标记，使之与理论质量有一个差异，然后通过质谱分析检测到这种差异，判断是在哪个氨基酸残基上发生了这种变化，最终确定糖基化位点[34]。

目前该策略所用到的切割糖链的方法有糖肽酶F(PNGase F)酶法、内切β-N-乙酰葡糖胺酶H(Endo H)酶法、β-消除-米氏加成反应等。其中PNGase F 酶法常用于流感病毒糖蛋白的研究中[35]，也是目前糖蛋白研究中应用最为广泛的一种N-糖蛋白鉴定方法。糖肽酶F几乎可以切除糖蛋白中所有N-连接糖链，同时使天冬酰胺转变为天冬氨酸，造成相对分子质量增加0.98，从而起到质量标记N-糖基化位点的作用。这种方法虽然简便，但缺点是不能区分自发脱氨基和酶促去糖基化，使得测定结果会产生误差[34,36]。糖链被切割后常用的质谱分析方法有基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、电喷雾离子化质谱( ESI-MS)、多级串联质谱技术等。

Chan等[37]在禽流感病毒(包括H7N9)感染猪离体组织的相关糖组学分析上就用到了质谱技术。他们将高致病性、低致病性禽流感病毒分别感染猪的气管和肺离体组织并进行病毒培养。一段时间后，在进行病毒的多糖提取前，所有组织先放在液氮中快速冻结。N-连接多糖的提取利用PNGase F进行消化，反向C18 Sep-Pak(水)色谱法进行纯化，然后将产物进行MALDI-TOF-MS分析。研究发现禽流感病毒易结合的SAα2-3Gal受体主要在猪的下呼吸道细支气管表达，而在气管、主支气管含量较少，说明猪不容易成为禽流感传播给人的中间宿主。

2.4生物信息学软件分析技术 近年来，国内外很多研究者也利用一些新型的生物信息学软件对流感病毒的HA、NA潜在的糖基化位点进行预测分析。

如Li等[38]将亚欧和美洲地区的H7N9流感病毒的HA、NA氨基酸序列提交至NetNGlyc 1.0 Server在线分析软件，预测其糖基化位点。研究发现所有H7N9病毒HA蛋白的糖基化位点完全一致。亚欧地区NA有7个糖基化位点，美洲地区NA有6～7个糖基化位点。在52位糖基化位点，亚欧地区为NTS、NAS或NVS，美洲地区为NAS，两个地区NA的其他糖基化位点均相同。他们还对我国7株新型H7N9病毒HA、NA蛋白的糖基化位点进行分析，发现与亚欧地区非人感染的H7N9病毒相比，7株新型H7N9病毒HA、NA蛋白的糖基化位点并未发生改变。所以推测病毒糖基化位点在此次流行的H7N9禽流感病毒致病性及宿主特异性改变上发挥作用较小。

3 结 语

目前，国内外在流感病毒蛋白糖基化及其功能等方面的研究还有待进一步深入，一些应用于流感病毒糖蛋白研究的相关技术也需要完善，但也取得了显著的成果。流感病毒糖蛋白HA、NA的变异对其增殖、毒力、宿主特异性等有重要影响。未来还可能出现新的流感病毒突变株，还需要继续在这些方面对其进行研究，为流感的防治提供新的手段。

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