具有免疫作用的多杀性巴氏杆菌外膜蛋白特性研究

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（铜川市动物卫生监督所，陕西铜川 727031）

具有免疫作用的多杀性巴氏杆菌外膜蛋白特性研究

田 亮，穆 秦，岳 登，付塞琴

（铜川市动物卫生监督所，陕西铜川 727031）

外膜蛋白是细胞膜的重要成分之一，在免疫方面的作用日益受到关注，对其深入研究可使开发有效的多杀性巴氏杆菌外膜蛋白疫苗成为可能，本文就多杀性巴氏杆菌概况、组成及具有免疫作用的外膜蛋白的特性进行综述，以期推动多杀性巴氏杆菌疾病的诊断和防治。

多杀性巴氏杆菌；外膜蛋白；免疫作用；研究

巴氏杆菌病致病菌主要包括多杀性巴氏杆菌（Pasteurellosis multocida，Pm）、溶血性巴氏杆菌和嗜肺性巴氏杆菌等，其中以多杀性巴氏杆菌存在较为普遍，该菌主要致使动物发生出血性败血病或传染性肺炎。目前所使用的疫苗在一定程度上对多杀性巴氏杆菌病的防治起到了一定的作用，但因多杀性巴氏杆菌的血清型较多（16种不同血清型）、疫苗的免疫谱窄（只对同型菌株的强毒攻击具有较好的保护）和保护期较短及抗菌药物效果不稳定（易产生耐药性）等原因，导致本病至今仍未能得到有效的控制。因此，研制安全且有交叉免疫保护性的亚单位疫苗来预防牛巴氏杆菌病是亟待解决的问题。膜蛋白是革兰阴性菌表面的成分，也是多杀性巴氏杆菌的一类重要的毒力因子。近年来，外膜蛋白在免疫学方面的作用越来越受到关注，随着对Pm外膜蛋白的深入研究，开发有效的多杀性巴氏杆菌外膜蛋白疫苗成为一种可能。

1 多杀性巴氏杆菌简介

多杀性巴氏杆菌有4个亚种，分别为多杀亚种、败血亚种、杀禽亚种和tigris亚种[1]。Pm主要以其荚膜抗原菌体抗原区分血清型，前者有6个型，后者分为16个型。外膜蛋白（outer membrane proteins OMPs）能够从不同程度上表现不同菌株间的变化，这可以用来评定菌株间的差异，从而确定流行病学关联性。目前Pm已经有多种外膜蛋白被检测、克隆并命名，主要有OmpH蛋白、OmpA蛋白、Oma87蛋白、PlpB蛋白、铁调节外膜蛋白等，并且有大量的研究证实多杀性巴氏杆菌的外膜蛋白可作为免疫原，对机体产生免疫保护作用，也可作为快速诊断试剂盒。这为多杀性巴氏杆菌外膜蛋白疫苗的研制奠定了基础。

2 外膜蛋白的定义及组成

OMPs是存在于细菌外膜之中的以及与外膜有关的所有蛋白质的总称，是革兰阴性菌外膜的主要结构成分，在细菌包浆膜（内膜）和肽聚糖层外侧包围着整个细菌，其厚度为8-10nm，约占细胞壁干重的80%，是典型的非对称性磷脂双层结构，外膜蛋白按其在细胞中的拷贝数高低分为主要蛋白和微量蛋白。主要蛋白包括外膜蛋白H（outer membrane ptotein H，OmpH）、外膜A蛋白（outer membrane protein A，OmpA）、微孔蛋白（Porins）、脂蛋白（Lipoprotein，Lpp）等。

3 具有免疫作用的外膜蛋白的特性

3.1 OmpH蛋白

OmpH是Pm菌体最主要的外膜蛋白之一，它是一种孔道形成蛋白，暴露于菌体表面，属于非特异性细菌外膜脂蛋白超家族。其分子质量一般为32～39 KDa，具有一般孔蛋白的特性，能够诱导高水平的保护性抗体。OmpH 蛋白也是Pm的一种主要的保护性抗原，免疫保护试验结果表明，OmpH蛋白能够对同源菌产生保护力[2]。

有研究人员认为外膜蛋白H（OmpH）是疫苗的理想候选者，能以高拷贝数表达，位于菌体表面并且具有免疫原性。Pm不同的血清型的该蛋白具有很高的同源性，有两个不连续的超变区与机体免疫系统相互作用。Luo等[3]研究表明：纯化的天然ompH能诱导100%的保护率，与全菌诱导的保护率相当，但重组的ompH不具有保护性。曹素芳等[4]用成熟外膜蛋白H重组亚单位疫苗免疫鸡，能够诱导鸡体产生较高的特异性抗体，其抗体水平明显高于禽Pm弱毒疫苗组和对照组。Tan H Y等[5]研究表明重组PmOmpH蛋白腹腔注射免疫小鼠其对Pm入侵保护率达100%，于此同时皮下注射保护率可达80%。表明重组OmpH蛋白能够作为疫苗合适的候选基因，并且为建立ELISA快速诊断试剂盒提供了可能。

3.2 OmpA蛋白

OmpA 蛋白属跨膜蛋白，又称修饰蛋白，具有热修饰性，该蛋白经SDS加热后进行SDS-PAGE电泳时，其涌动速度明显减慢。有研究表明，该蛋白除了具有维持外膜结构的作用外，主要是在细菌感染早期与细胞基质相互作用，定植于宿主细胞。外膜蛋白A序列具有很高的保守性，良好的免疫原性，可刺激细胞免疫和体液免疫[6]。据报道，重组的Omp A 蛋白能够引起强烈的Th2 类型的免疫反应，能够产生较高水平的IgG 抗体等特点。研究表明，牦牛源Pm的重组OmpA的保护性达40%，保护性低于全菌灭活组的80%[7]。

3.3 PlpB蛋白

2001年PlpB蛋白被提纯，并证实其与血清间的交叉保护有关，而且发现该蛋白位于Pm细胞的表面或外围。王红勋等[8]首次将PlpB基因克隆到融合表达载体pGEX-KG中，并用琼脂双向扩散试验检测血清抗体效价。结果表明，所构建的原核表达重组质粒pKG-plpB在大肠杆菌BL21融合表达的蛋白plpB能诱导小鼠产生免疫反应，可保护小鼠抵抗强毒的攻击，这种免疫保护作用也可通过血清被动传递给非免疫小鼠，使后者获得对强毒的抵抗力。

3.4 铁调节外膜蛋白

限铁条件迫使细菌产生高亲合性的摄铁系统，主要有转铁蛋白受体（Tbpn），乳铁蛋白受体（Lbp）、血晶素/血红素锚定蛋白受体（HgbMB）及亚铁血红素获得系统受体（HasR）等，其与宿主竞争摄取铁离子复合物，从而获取铁满足自身代谢需要，这类蛋白属于外膜蛋白家族。它们仅在限铁条件下表达，故被称之为铁调节外膜蛋白（IROMPs）。顾宏伟等[9]用间接ELISA法分别定量分析了兔源PmCSI-17的99kD IROMPs交叉抗体滴度，结果表明：该蛋白在不同的菌株之间存在良好的抗原交叉性，从而推测该IROMPs为重要的保护性抗原。Prado ME等[10]给牛注射了Pm232活菌苗或者铁调节外膜蛋白，都能够产生很强的免疫应答反应。表明IROMPs是Pm的主要抗原基因之一。

3.5 其他外膜蛋白

除了以上具有免疫作用的外膜蛋白外，Kasten等[11]分离、鉴定了P6样外膜蛋白蛋白具有抗原性；Ruffolo 等在大肠杆菌中成功表达的重组Oma87产生的抗血清能够对小鼠产生免疫保护作用；Bisweswar等[12]发现用纯化重组OmpW蛋白的抗血清可保护乳鼠免受霍乱弧菌活菌的攻击。因此推测Pm OmpW的重组蛋白也能够抵抗Pm的攻击。

4 展望

多杀性巴氏杆菌Omps具有良好的免疫原性，不仅可激发机体的体液免疫，而且可引起细胞免疫，并且还可通过遗传工程技术大量表达，这一结论已经得到证实。然而，多杀性巴氏杆菌重组OmpH、OmpA等单一抗原基因的疫苗免疫性还没有一致的结论，这可能使由于单一的抗原基因可能不足以产生抵抗强度攻击的保护力。因此，可以以OMPs型为依据，选择优势免疫保护抗原或构建多价融合性OMPs菌株，或许能够解决单一抗原基因免疫效果不佳及全菌灭活苗等传统疫苗免疫谱窄，存在安全隐患等问题，必将会大大推动多杀性巴氏杆菌疾病的防治和诊断。

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Studies on the Features of Outer Membrane Protein with Immune Action of Pasteurella multocida

Tian Liang，Mu Qin，Yue Deng，Fu Saiqin
（Tongchuan City Animal Health Supervision Institute，Tongchuan，Shaanxi 727031）

Outer membrane protein is an important component of cell membranes，and its immune role is attracting much concern. The development of effective Pasteurella multocida outer membrane protein vaccine is possible due to deepening its study. In this paper，Pasteurella multocida profle，composition and outer membrane proteins with immune action were reviewed in order to promote the prevention and diagnosis of Pasteurella multocida disease.

Pasteurella multocida；outer membrane protein；immune action；research

文献标识码：B

：1005-944X（2014）08-0029-03