基层兽医站实验室抗体检测方法简介

刘永香

（四川省雅安市雨城区八步乡畜牧兽医站，四川雅安 625000）

长期以来，动物传染病不仅给畜牧业造成巨大的经济损失，同时，也直接威胁到人类自身的生存和发展。鉴于人类健康与动物联系日益紧密的现状，雨城区采取注射疫苗的方法预防和控制重大动物疫病。而疫苗在动物机体中产生抗体的效果直接影响到重大动物疫病的控制、发生和发展，做好抗体水平监测利于制定科学的免疫程序、评价疫苗的质量、预警重大动物疫病等。

1 基层兽医站技术条件现状分析

1.1 部分基层兽医站办公条件差

实验室软件和硬件仪器设备不到位，有些仅有一些最基本的设备设施，如防疫包、手术剪刀、夹镊子、烧杯、烧瓶、离心机等，有些地方甚至没有实验室。每次做抗体检测都要送到区、市或省实验室。这样，不仅样品采集、运输、保存耽误很多时间，耗费人力，并且需要加大经费的投入。

1.2 专业知识有待提高

由于基层兽医站的技术人员部分来自乡村兽医，未经过专业理论学习，对于开展抗体检测的知识缺乏。

1.3 只用购买的金标试纸条，成本较高

2 实验室凝集试验

2.1 血凝试验和血凝抑制实验

凡具有血凝特性的病毒均可选用，如，新城疫病毒、禽流感病毒、禽传支病毒等。

2.1.1 目的

通过滴定病毒的血凝效价，可用于监测血清中抗体水平，也可用于判断未使用疫苗群体的感染状态等。

2.1.2 实验器材及试剂

待检病毒（可购买）、待检血清、生理盐水、1%鸡红细胞悬液、96孔V形微量血凝板、加样器、离心机等。

2.1.3 实验方法及步骤

（1）血凝试验（HA）：取96孔V形血凝板，按以下步骤操作：

第1步：第1排1～12孔各加生理盐水50μl；

第2步：吸50μl病毒液于第1排第1孔，混匀后取50μl至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去50μl；

第3步：第1排1～12孔加1%鸡红细胞悬液50μl，微型震荡器震荡2 min（如没有可用手轻拍）混匀；

第4步：37 ℃温箱静置30 min；

第5步：判定结果，将血凝板倾斜45°，看是否呈泪滴状，不呈泪滴状的说明发生血凝。以4单位抗原进行血凝抑制实验。

（2）血凝抑制实验（HI）：配置4单位抗原，取96孔血凝板，按以下步骤操作：

第1步：第1排1～12孔各加生理盐水50μl；

第2步：吸50μl病毒液于第1排第1孔，混匀后取50μl至第2孔，依次稀释至第10孔，弃去50μl；11孔加阳性对照血清；12孔加阴性对照血清；

第3步：第1排1～12孔各加4单位抗原50μl；

第4步：第1排1～12孔加1%鸡红细胞悬液50μl，微型震荡器震荡2min（如没有可用手轻拍）混匀。

第5步：37 ℃温箱静置20 min；

第6步：判定结果，将血凝板倾斜45°，以孔底沉淀的红细胞流动性好，呈泪珠样流淌，边缘无凝集颗粒为凝集完全抑制。以此判定免疫动物的抗体水平。

2.2 牛布鲁氏菌虎红平板凝集实验

猪牛羊检测皆可采用此法。

2.2.1 实验目的

用布鲁氏菌缓冲抗原诊断布鲁氏菌病的一种简便方法。

2.2.2 实验器材及试剂

被检血清、玻璃平板、布病虎红抗原（购买）、标准阴性对照血清、阳性对照血清（购买）、吸管或分装器。

2.2.3 实验方法

第1步：将玻璃板上各格标记受检血清号，然后加相应的血清30μl；

第2步：在每孔滴加抗原30μl；

第3步：设阴、阳性对照；

第4步：用牙签类小棒搅动血清和抗原使之混合，室温（20 ℃）5～10 min内记录反应结果；

第5步：判定结果：在阴阳性血清对照成立的条件下，方可对被检血清进行判定。受检血清在4 min内出现肉眼可见凝集现象者判为阳性（+），无凝集现象，呈均匀粉红色者判为阴性（-）。

2.3 间接血凝实验

猪瘟、口蹄疫检测均可采用此法。

2.3.1 目的

对动物疫病的早期诊断以及测定免疫动物血清抗体效价。

2.3.2 器材及试剂

被检血清、6孔微量血凝板、微量移液器、间接血凝抗原（购买）、阴性对照血清、阳性对照血清（购买）、稀释液。

2.3.3 实验方法

第1步：诊断前，将间接血凝抗原加稀释液浸泡7～10 d前；将待检血清在56 ℃水浴锅灭活30 min；

第2步：第1排1～6孔各加稀释液50μl；

第3步：吸50μl被检血清于第1排第1孔，混匀后取50μl至第2孔，依次稀释至第6孔，弃去50μl；

第4步：设阴性和阳性地照血清；

第5步：第1排1～6孔各加血凝抗原25μl震荡混匀。将血凝板置于微量振荡器1～2 min，（如无振荡器，用手轻拍混匀亦可）。室温或37 ℃下静置1.5～2.0 h后判定结果；

第6步：判定结果：先观察阴性血清对照和稀释液对照孔，红血球应全部沉入孔底，无凝集现象（－）或呈阳性（+）的轻度凝集为合格；阳性血清对照应呈（+++）凝集为合格。

在以上3孔对照合格的情况下，观察待检血清各孔的凝集程度，以呈“++”凝集的待检血清最大稀释度为血凝效价（血凝价）。血清的血凝价一般以达到1∶16为免疫合格。

3 酶联免吸附实验（ELISA）

可用于猪细小病毒、猪蓝耳病、猪乙型脑炎、伪狂犬、猪瘟、口蹄疫等抗体检测。

3.1 目的

酶联免疫吸附（ELISA）试验具有灵敏性、特异性高，且重复性好，检测速度快的特点，尤其适合于大批量血清样品的检测，是国际认可的标准化诊断方法。

3.2 器材及试剂

被检血清、多孔移液器及一次性枪头、国标试剂盒（购买）、酶标仪、EP管、离心机、酶标仪、恒温箱等。

3.3 方法

严格按照试剂盒说明进行，具体步骤如下：

第1步：样本稀释：用样本稀释液将待检血清按比例稀释，充分混匀；阴性对照血清、阳性对照血清不用稀释，直接加样。

第2步：加样反应：取出所需反应板条，样本检测孔每孔分别加已稀释样本血清 50μl。同时设阴性、阳性及空白对照各1孔，取阴性、阳性对照各50μl分别加入反应孔内，空白对照孔仅加入25μl样本稀释液。

第3步：37 ℃避光反应30 min后甩去孔内液体，每孔加洗涤液1滴，立即用蒸馏水注满，静置30 s后甩去，再直接用蒸馏水洗涤4次，每次均静置30 s后甩去，最后1次甩去拍干。

第4步：加酶反应：除空白对照孔外其余每孔加酶结合物2滴，37 ℃避光反应30 min后甩去孔内液体，如上洗涤，拍干。

第5步：显色反应：加底物 和显色剂各1滴，混匀，37 ℃下避光显色10 min。

第6步：加终止液1滴，混匀，终止反应（加终止液后蓝色会变为黄色）。

第7步：结果判定：

肉眼观察：阴性对照接近无色，阳性对照呈明显黄色，表示试验有效。待检孔接近无色表示该标本为阴性，待检孔呈明显黄色表示该标本为阳性。

仪器判断：以空白对照调零用酶标仪于 450 nm（620 nm作参比波长）读取OD值，待检孔OD值大于阴性2.1倍者为阳性。当阴性对照OD值低于0.05时按0.05计算。

4 注意事项

以上样品量是举例说明，在实验操作过程中应严格按照试剂盒和操作规程进行。