血凝试验和血凝抑制试验用于禽流感抗体检测

常耀祖 杨永春 施进文

（宁夏同心县动物疾病预防控制中心，宁夏吴忠 751300）

近年来，高致病性禽流感疫情在世界各地均有发生，人感染高致病性禽流感的事件越来越多。预防高致病性禽流感已成为全球性的大事。防制高致病性禽流感的主要措施是对禽鸟进行禽流感疫苗的预防接种，同时，提倡有效免疫，要求免疫的禽只体内产生足够高的抗体，以抵御禽流感病毒的侵袭。为此，我国各地的动物防疫监督机构需要对禽鸟进行定期的禽流感疫苗抗体水平的监测。

对禽流感抗体水平的监测一般采用血凝试验和血凝抑制试验（HA-HI试验），其技术规范依照GB/T18936-2003进行。该试验方法具有经济、操作简便和对抗体水平进行量化的优点，已在各地动物防疫监督机构和养殖场广泛使用。

1 样品的保存

（1）采集的血液样品应及时分离血清，最好分装至离心管中，标记清楚，离心后吸出血清，对应编号冷藏送检，并禁止运输过程中剧烈震动。

（2）一般情况下，在5 d内检测的样品可放置在4 ℃的冰箱中冷藏，否则，低温冷冻保存。

（3）在检测前血清样品应充分混匀，混匀时采用上下缓慢颠倒几次的方法即可，切忌剧烈振荡，引起产生气泡及血清中蛋白变性。

（4）对出现胶胨状的血清样品，可采用反复搅动几下，再离心的方法有助于缓解该状态。胶状物是含纤维蛋白和纤维蛋白原的血清，可能是由于放置时间不够，造成血清未完全析出。不建议直接吸取其中少量的清亮血清。

2 材料准备

检测使用96孔90°V型微量反应板，要确保每个孔清洁，每次使用后要立即用清水冲洗孔中的反应物，通过反复试验证明：90°V型板相对于110°板及130°板来讲，具有红细胞沉降速度快，产生的凝集图像清晰、结果容易判定等优点。

3 移液枪的使用

（1）单道、多道可调微量移液枪，应选择合适的量程，以便精确度的提高。

（2）使用时，应采用一档吸液、二档排液的方法。吸取液体时，枪头要深入液下，缓慢平稳吸液。加缓冲液时，应加在板孔底部。倍比稀释血清时，应每孔至少反复吹吸6次，以便混合均匀。注意：尽量避免产生泡沫引起混合不均。加抗原及红细胞时应在板内液面上方加样，以免交叉污染，影响试验结果。

（3）加样、倍比稀释时，应高度集中注意力，以免漏加、重复加样等。

4 试剂的保存及配制

（1）禽流感血凝抑制试验所用的抗原、阳性血清应严格按照说明书的要求进行保存和配置，试验前应提前将其恢复至室内温度。抗原的保存温度为-20 ℃，反复冻融会降低抗原的滴度，应避免反复冻融。

（2）pH 7.2、0.01 mol/L的PBS液的制备：

①应尽量现用现配；

②每次使用前应测pH值，以免时间过长而导致pH值发生改变；

③由于pH试纸跨度范围偏大，pH值不易准确界定，最好采用酸度计准确测量pH值，以提高试验的精确度；

④全部试验均采用同一种稀释液。

（3）1%红细胞制备的注意事项

①为避免鸡只红细胞发生自凝现象，在配制1%红细胞悬液时，最好选择采取2～3只SPF鸡，或未进行过任何免疫的成年公鸡血液。采血的前提条件是要按1/10采血量的比例在一次性注射器中加入抗凝剂，如，肝素、枸椽酸钠、柠檬酸钠等。

②采血完毕后，分装至2 ml容量的圆底离心管中，因为通过2 ml与1.5 ml两种容量离心管相比较，放入1.5 ml尖底离心管时，离心后，离心管底部红细胞不易与加入的PBS液混匀，易沉积在管底部，达不到洗脱干净的目的。

③经2 000～3 000 r/min，5～10 min，弃去上液和红细胞上层的白细胞薄膜，再加入10倍以上血量的PBS液，上下缓慢颠倒（切忌用力过大使红细胞破裂），使其充分混匀，再离心弃去上清液，反复几次，直至上清液清亮透明为止。

④在加红细胞过程中，还须不断轻摇，以确保红细胞均匀，使其每孔加入相同数量的红细胞。

⑤制备好的红细胞液如果放置后上清液变红，说明有溶血，不可再使用。

5 抗原液的配制

①先做血凝试验测定效价，以抗原与红细胞完全凝集的孔为1HUA抗原，配制4HUA抗原应往前推算2孔，即除以4后的值。

②每次做试验前，必须重新检测禽流感抗原的血凝效价，以免效价发生改变而导致抗原稀释倍数不准确，从而导致试验结果不准确。

③为保证配制的抗原准确，还要进行抗原回滴试验。具体方法：做2排抗原回滴，在2排的第1～8孔各加25 μl PBS，取4HAU抗原25 μl加在第2排的第1孔、第2孔，混匀，从第2孔倍比稀释至第4孔，弃去25 μl，另一排同样。从第2至第8孔补25 μl PBS，以保持75 μl总量不变，另一排同样。2排的第1～8孔各加25 μl 1%红细胞，震荡10 s。静置30 min观察结果。这样在第1孔为4HAU抗原，第2孔为2HAU抗原，第3孔为1HAU抗原，第4孔为1/2HAU抗原，均为75μl总量，第5～8孔为空白对照。如果抗原回滴试验不成立，应相应调整抗原浓度直至回滴试验成立。原因：如果抗原浓度过高，则所测定的抗体效价水平偏低，如果抗原浓度过低，则所测定的效价偏高。所以不调整抗原浓度至实验成立的话会对结果有很大影响。

6 结果判定

每次试验必须设阳性及阴性（空白）对照血清，判别试验是否成立。判读结果时，将酶标板倾斜45°，以孔底沉淀的红细胞流动性好，呈泪珠样流淌，边缘无凝集颗粒为凝集完全抑制。

试验器具的清洗每次试验完毕后，应将酶标板中液体甩净，然后用自来水反复冲净每个孔，再放入3%NaOH中4 h，清水反复冲净，再放入3%HCl中4 h，清水反复冲净，再用蒸馏水反复冲洗几次，甩干水分，入干燥箱中干燥备用。实验用烧杯、加样槽、量筒等也应充分洗净、干燥，以免器具内有杂物、污物以及残留物从而影响试验结果。

7 体会

在进行禽流感血凝抑制试验时，应充分考虑到各方面的影响因素，提供的检测结果才会真实可靠，准确掌握禽类的免疫抗体水平，进而为科学防控禽流感提供理论依据。