欧洲食品安全局动物饲料添加剂和饲料产品委员会关于动物营养中屎肠球菌的安全性评估指南

中国饲料工业协会 王黎文 译

1 前言

众所周知，肠球菌是胃肠道的人畜共生菌，与许多动物一样，多数人群一般都会携带。人类肠球菌感染包括心内膜炎、尿路感染以及由粪便微生物污染造成的腹腔或盆腔感染（Murray，2000），但感染发生在医院等医疗机构之外的病例极为罕见。

在当今医疗机构中，肠球菌菌株通常是从感染病例分离回收获得。第一次大范围的与医院有关的肠球菌感染 （主要是粪肠球菌）是在20世纪80年代伴随对广谱头孢菌素的使用（肠球菌对其有抗性）以及免疫系统受损病人数量的增加而产生，这也是肠球菌感染的主要原因。广谱头孢菌素杀死了胃肠道中的大多数固有微生物，但由于肠球菌对其具有抗性而存活下来。因此，肠球菌菌群存在于大多数住院病人的肠道内，且数量巨大。植入导管、免疫抑制以及化疗导致的黏膜发炎等影响因素改变了以往宿主的菌群平衡，进而促进了菌体感染的发生。患者的抗生素使用似乎是引发可控共生菌感染的关键因素（Ubeda 等，2010；Murray，2000）。

在20世纪90年代初，医疗机构临床分离得到的肠球菌中，90%～95%为粪肠球菌，仅有5%为屎肠球菌。在过去的15～20年中，美国从医疗机构感染区域分离得到的屎肠球菌已经明显增多，目前大约已占35%。与此同时，相对于社区环境中发现的屎肠球菌而言，源于医疗机构的屎肠球菌分离株对氨苄青霉素和哌拉西林具有更为普遍的抗性。在美国还发现，这一具有氨苄青霉素抗性的屎肠球菌对万古霉素也具有抗性。目前，70%来自美国医疗机构的屎肠球菌分离株具有万古霉素抗性，而90%具有氨苄青霉素抗性。相反，仅1%～5%的粪肠球菌对这两种抗生素具有抗性，这可能是医疗机构中屎肠球菌相对于粪肠球菌增多的原因，即主要是由于频繁使用对粪肠球菌有抑制作用的抗生素所导致的 （Bertics等，2009；Hidron 等，2008）。

在欧盟，具有万古霉素抗性的屎肠球菌菌株（VER）是在20世纪80年代首次被检出，这些菌株是从使用糖肽阿伏霉素的养殖场动物的粪便中分离得到的，其中大多数是氨苄青霉素敏感菌株。从动物源性食品和健康人群的粪样中也分离得到了屎肠球菌菌株。然而，上述屎肠球菌菌株在医院之外的感染很少见。最近，在欧盟的住院患者中已经发现了具有氨苄青霉素抗性的屎肠球菌，其中部分像早些时候在美国一样，也已经获得了万古霉素的抗性，而且在医疗机构中的感染频率正在上升，现在占到医院肠球菌感染的40%～50% （Werner 等 ，2008；Top 等 ，2007；Leavis等，2003；Bonten 等，2001）。

目前已经认可屎肠球菌由两个不同的亚种或分支组成，并且分支可能早在成千上万年前就已经形成。这些分支可以通过多位点序列分型（MLST）来区分，即通过共有核心基因的序列比对、是否含有IS16插入序列和其他获得元件，以及是否具有对氨苄青霉素的抗性来判定菌种属于哪个分支。其中一个亚种（2012年Palmer等根据全基因组系统发生法将其称为B分支）主要是从健康人群粪便中分离得到的，且对氨苄青霉素敏感；另一个亚种（A分支）包括多数医疗机构临床分离的具有氨苄青霉素抗性的菌株 （Palmer等，2012；Galloway-P en～a 等 ，2011；Willems 和 van Schaik，2009；Leavis等，2007），同时，A 分支也包括具有氨苄青霉素抗性的来自于狗的分离菌株（De Regt等，2012）。 根据MLST数据进行菌群遗传分析后预测，源于养殖动物的氨苄青霉素敏感菌株也将归至A分支。

2 屎肠球菌的系统发育学和基因组学

屎肠球菌的进化关系分析大多采用MLST法，该方法中等位基因图谱依据7个看家基因序列而测定 （Homan等，2002）。第一个关于屎肠球菌种群结构的MLST研究是针对全球范围收集的人类来源（医院和社区分离的）和非人类来源（动物和环境中分离的）屎肠球菌菌株进行的表征研究，同时定义了175个序列类型 （STs）。用e-BURST软件对序列类型进行分组，将任意大小的MLST数据集分解成与分离株相关或与克隆复合体（CCs）相关的数据组，并预测每一个CC的起源基因型。该项研究表明，全球大多数医院分离的代表性菌株，其基因型和进化史关系都十分相近，同属于某一CC，该CC被命名为CC17（Willems等， 2005）。

然而，根据当前MLST数据库（http://efaecium.mlst.net/）中所有有效的STs并利用eBURST软件所推测出来的屎肠球菌的菌群结构，是一个庞大的CC，包括先前命名的CC17，同时也包括次要的CC和序列。该数据库涵盖了69%的屎肠球菌的STs（Willems等，2011）。这些发现和基因组基础研究表明，从医院分离得到的屎肠球菌并不是最近才从单一的共同祖先进化而来（van Schaik等，2010），因此，最初确定CC17为医院屎肠球菌的CC很有可能是错误的。

相反，从医院分离得到的菌株构成了一个多克隆屎肠球菌亚种，且具有明显的进化克隆体（Willems 等，2011；Willems 和 van Schaik，2009）。比较基因组杂交和基因组测序发现，屎肠球菌临床分离株富含某几个基因，其中最具代表性的就是 IS16插入序列 （van Werner等，2011；Schaik等，2010；Leavis等，2007）， 该基因可能赋予了屎肠球菌对其宿主一定程度的基因组适应性，从而促进其获得与毒性或与抗生素抗性相关的额外基因元件。

MLST和基因组测序同时还揭示了来源于健康人群的菌株呈现一个明显的区分簇 （Zhang等，2011；van Schaik 和 Willems，2010）。 这些菌株可能已经适应了哺乳动物共生菌的生活。Galloway-Pen～a等（2011）也鉴定了屎肠球菌两个主要亚种之间的区别，并以其对氨苄青霉素的抗性进行表征。

3 氨苄青霉素抗性

事实上，从医院感染患者分离得到的大多数屎肠球菌菌株属于同一个分支，且与另一个分支明显不同，两个分支内在本质的区别可能能够解释其不同的感染情况。区别之一就是从医院分离菌株具有氨苄青霉素抗性（MICs>128 mg/L），并引发菌株产生对哌拉西林的交互抗性以及对头孢菌素的高度抗性。在经常使用万古霉素、头孢菌素和哌拉西林的医院中，耐药菌所具有的β-内酰胺类药物抗性和万古霉素的抗性为其提供了选择优势（Murray，2000）。

此外，当肠道中革兰氏阴性细菌被抗生素抑制时，抗肠球菌宿主的凝集素RegIIIγ的负调节作用使得肠球菌得以增殖（Brandl等，2008）。

细胞壁合成酶通常被认为是青霉素结合蛋白质（PBPs），这是因为青霉素通过结合这些蛋白质，以削弱其细胞壁合成功能来抑制细胞壁的形成。PBP5是一种屎肠球菌细胞壁合成酶，其蛋白质的编码基因是屎肠球菌核心基因组的一部分。像屎肠球菌两个分支的多数共有基因一样，PBP5的编码基因存在两个等位基因，即pbp5-S和pbp5-R，二者的DNA序列有5%的差异。屎肠球菌中PBP5-S和PBP5-R的氨基酸序列差异是决定其是否具有氨苄青霉素抗性的主要因素。在已测序菌株中，从感染患者分离到的屎肠球菌菌株（分支A）具有pbp5-R基因，而社区健康人群中分离到的绝大多数屎肠球菌菌株（分支B）具有pbp5-S基因。进一步研究比较氨苄青霉素对每个菌株pbp5基因的最低抑菌浓度（MIC）发现，32株氨苄青霉素MIC>4 mg/L的屎肠球菌菌株都具有pbp5-R基因，氨苄青霉素MIC<4 mg/L的屎肠球菌菌株具有pbp5-S基因，而在氨苄青霉素MIC=4 mg/L的屎肠球菌菌株中，有的含pbp5-R基因，有的含pbp5-S基因。因此，氨苄青霉素MIC≤2 mg/L能够准确地排除主要从病人处分离得到的菌株 （分支A），并排除胃肠道中对氨苄青霉素、阿莫西林或结构类似的抗生素可能有选择性优势的菌株（Galloway-等，2011；Rice等，2004）。

4 毒性因子和与医院分离菌株有关的标记物

肠球菌已经被广泛认为是条件致病菌，尤其是屎肠球菌，它是医疗机构中发现的几乎唯一可引发感染的病原菌 （Willems和 van Schaik，2009）。很多可能与屎肠球菌毒性有关的因素已经被确认，但对于安全性评估，下列毒力因子和标记物与安全性最为相关：

4.1 IS16（医院分离菌株标记物） IS因子是最简单的转座因子，只编码对其转位所必需的酶。肠球菌有大量的可移动遗传元件，IS16可以在诸如Tn1547转座子的侧翼等位置被发现，该因子使屎肠球菌具有万古霉素抗性。IS16是医院分离的屎肠球菌亚种（分支A）的一个特殊的标记物，同时也是临床粪肠球菌分离株的标记物 （Hegstad等，2010）。 Werner等（2011）研究发现，97%的血培养屎肠球菌菌株显示IS16阳性，但是，仅4%的人畜共生菌菌株携带该因子。

4.2 Esp[致病岛（PAI）标记物] Esp 是一个约200 kDa的屎肠球菌表面蛋白，通过LPxTG型基序与细胞壁以共价键连接 （Heikens等，2007；Leavis等，2004）。esp基因是一个大型致病岛（60～100 kbp）的一部分，该岛同时携带其活动基因（Top 等，2011；van Schaik 等，2010）。esp 基因在屎肠球菌生物膜的形成中发挥着重要作用（Heikens等，2007），并已有试验证明esp基因能够促使模型动物心内膜炎 （Heikens等，2011）和尿路感染（Leendertse等，2009）的发生。esp基因广泛存在于具有氨苄青霉素和万古霉素抗性的屎肠球菌分离株中（Vankerchoven 等，2004；Rice 等，2003）。

4.3 hyl-like基因 HylEfm最初被描述为一种透明质酸酶，但最近被认为是一种糖基水解酶。糖基水解酶可促进肠道细菌菌群的定植（Freitas等，2010）。来自社区分支的菌株几乎不含hyl-like基因的大质粒，然而，医院分离的菌株则通常具有该基因，比例约为30% （Rice等，2003）。hyl质粒已被证明能够提高小鼠胃肠道细菌的定植能力，同时提高腹膜炎模型小鼠的死亡率，因此，对至少一部分来自医院分支中的菌株的生长有促进作用（Panesso 等，2011；Rice 等，2009）。

5 评估

该评估的主要目的是将属于医院相关分支的菌株排除在动物营养中使用的屎肠球菌之外，原因在于消费者中的易感人群可能会受到其危害。

安全性评估之前，必须采用适当的分子学方法鉴定其确实属于屎肠球菌，之后测定氨苄青霉素的最小抑菌浓度。

若MIC>2 mg/L，则该菌株被认为是不安全的，不应用作饲料添加剂。

若MIC≤2 mg/L，应检测菌株是否含有IS16、hylEfm和esp遗传元件（方法见附录）。

若检测不到三个遗传元件中的任意一种，那么该菌株用作饲料添加剂使用则可以认为是安全的。

若检测到三个遗传元件中的一种或多种，那么该菌株则被认为是不安全的，不应用作饲料添加剂。■

附录推荐方法

1 氨苄青霉素的MIC

测定氨苄青霉素的MIC时，应采用琼脂或肉汤培养基并运用连续两倍稀释法，同时使用与之相关的质量控制菌株。测试应当按照国际公认的标准进行，如欧盟委员会的抗生素敏感性测试（EUCAST）、临床实验室标准化协会（CLSI）、国际标准化组织（ISO）等机构制定的标准或其他类似标准。菌体培养后，MIC被定义为抑制细菌生长的最低抗生素浓度。一般不允许采用定性或半定量方法来间接测定MIC，如扩散法。

2 医院分离菌株相关的标记物检测

如有可能，需要进行包括染色体和质粒在内的全基因组分析，来筛查是否存在IS16、esp和hyl基因。此外，也可以采用以下方法来分析：

2.1 IS16 推荐使用 Werner等（2011）的方法来检测IS16，并使用以下PCR引物：IS16-F（正向）5'-CATGTTCCACGAACCAGAG 和 IS16-R（反向）5'-TCAAAAAGTGGGCTTGGC（屎肠球菌的目标片段预计为547 bp）。PCR分析应使用阳性和阴性对照菌株，屎肠球菌DSMZ 25390可作为阳性对照菌株，屎肠球菌DSMZ 25389可作为阴性对照菌株。

2.2 esp 检测esp基因最好采用杂交技术，因为该方法很少依赖于引物结合位点的点突变，而点突变可导致假阴性结果。制备探针的引物为：esp14F （正向）5'-AATTGATTCTTTAGCATCTGG-3'和esp12R（反向）5'-AGATTTCATCTTTGATTCTTGG-3'（Leavis等， 2003）。 Hendrickx 等（2007）描述了用于Southern印迹的杂交条件，而Rice等（2003）和Hendrickx等（2007）描述了用于斑点印迹的杂交条件。菌落裂解物也可以用于杂交 （Singh等，1998）。杂交分析应使用阳性和阴性对照菌株，屎肠球菌DSMZ 25390可作为阳性对照菌株，屎肠球菌DSMZ 25389可作为阴性对照菌株。

2.3 hylEfm 推荐使用Rice等（2003）的方法来检测hylEfm基因，采用以下PCR引物：5'-GAGTAGAGGAATATCTTAGC-3' （nt 856-nt 875）和反向引物hylEfm 5'-AGGCTCCAATTCTGT-3'（nt 1517-nt 1503）[屎 肠 球 菌 ATCC BAA-472（TX16）的目标片段预计为 661 bp]。

作为一种替代方法可以采用菌落裂解物杂交或 Southern印迹杂交法 （Rice等，2003；Singh等，1998）。基因探针的引物为：正向引物hylEfm（5'-GTT AGA AGA AGT CTG GAA ACC G-3'；nt 149-nt 170）， 反向引物hylEfm （5'-TGC TAA GAT ATT CCT CTA CTC G-3'；nt 876-nt 855）， 屎 肠 球 菌ATCC BAA-472（TX16）的目标片段预计为727 bp。

PCR和杂交技术应使用阳性和阴性对照菌株，屎肠球菌DSMZ 25390可作为阳性对照菌株，屎肠球菌DSMZ 25389可作为阴性对照菌株。