基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在临床微生物鉴定中的应用

林豪芸，吴文苑

微生物作为多数疾病或者感染的始作俑者，对它种属的鉴定和诊断十分必要。微生物分型就是针对不同菌株的特点、表型及基因型的相似性和差异性，对它们进行鉴定和登记入册；为了提高微生物鉴定分型的灵敏度、分辨率、可靠性、速度及成本效益等，其方法的不断创新和发展是必须的。

质谱分析技术（Mass Spectrometry，MS）是指带电原子、分子或分子碎片按质荷比（或质量）的大小顺序排列的图谱。样品离子化是进行质谱分析的前提，但经典的离子源通过高温或高能电子破坏样品分子使之汽化，会导致大分子物质产生不可预知的降解而失去分析意义。20世纪80年代后期发展的“软电离”技术使得质谱分析技术能够用于生命科学研究领域，软电离技术能够保持大分子或分子复合物在研究分析过程中的完整性。

基质辅助激光解吸／电离飞行时间质谱（Matrix－assisted laser desorption／ionization time－offlight mass spectrometry，MALDI－TOF MS）是近年来发展的一种软电离新型有机质谱，以检测各种特异性片段重量来测定个体，它因其快速和可靠鉴定微生物这一强大功能在常规实验室工作中得到微生物学家和临床工作者的重视。它通过引入基质分子，使待测分子不产生碎片，解决了非挥发性和热不稳定性生物大分子解吸离子化的问题。

1 MALDI－TOF MS的基本概况

1.1 MALDI－TOF MS基本组成与原理 MALDI－TOF MS仪器主要由两部分组成：基质辅助激光解吸电离离子源（Matrix－assisted laser desorption／ionization，MALDI）和飞行时间质量分析器（Time－of－flight，TOF）。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量使样品解吸，样品分子通过与基质之间发生电荷转移而得以电离；TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，因为离子的质荷比（M／Z）与离子的飞行时间成正比，所以不同质量的离子因到达检测器的飞行时间不同而被检测，形成不同的质量图谱。根据不同细菌所特有的蛋白，应用MALDI－TOF MS使细胞表面蛋白质形成不同的模式峰，与人类病原体数据库中的蛋白质指纹图谱进行比较，从而对该微生物的类别进行鉴定，这是一种与传统鉴定方法完全不同的新型鉴定手段。

1.2 MALDI－TOFMS中的基质化合物在MALDI－TOF MS技术中基质化合物是快速鉴定蛋白质、核酸、脂质等生物分子，保持它们完整性的必要物质。基质溶液为溶剂混合物，通常由水、乙醇、甲醇、乙腈和强酸，如三氟乙酸等组成，基质溶液应有低分子量及低挥发性等特点，酸性的基质因其能为样品电离提供质子而常被使用。基质溶液可以渗透细胞壁，使胞内蛋白质得以分析。当细胞悬浮液中的溶剂蒸发时，基质晶体开始形成，而其中的蛋白质分子和其他细胞化合物嵌入当中，被称为“共结晶过程”。在使用的基质化合物中，大部分是有机的、小分子量的芳族羧酸，如苯甲酸或肉桂酸衍生物。当前常使用的两种基质溶液是：2，5－二羟基苯甲酸和氨基－4－羟基肉桂酸。这些基质化合物被证明在大多数情况下适用于分析鉴定各类微生物，然而为了进一步扩大MALDI－TOF MS的应用范围，还需继续开发应用于特定领域的基质化合物。

1.3 MALDI－TOF MS的数据库 数据库中所包含的可靠全面的参考物种数据是获得准确微生物鉴定的先决条件。出于临床目的的考量，数据库中应包含全部有关致病菌及各自密切相关的菌种。由于微生物在核苷酸序列、生化特性、质谱指纹上通常显有一定程度的种内变异，所以挑选的物种应代表多个菌株，即覆盖自然多样性的物种；另外，数据库中收集的菌株光谱应来自标准化培养条件下的菌株。微生物鉴定中的一个重要信息就是样品峰值列表中的质荷比及强度，即所谓的样品的质谱指纹图谱。通过与数据库进行比较，以微生物质谱相似程度的效值作为微生物的质谱比较结果。从效值清单列表中，获得样品的分类鉴定结果。目前因 MALDITOF MS数据库不完善，对于某些类别的菌株可能会出现鉴定失误的情况。所以数据库的不断发展是拓宽MALDI－TOF MS在微生物诊断领域应用范围的关键。

MALDI－TOF MS的数据库可由实验室内部人员进行修改和编辑，数据库市售软件定期更新。它可以建立一个用户菌株光谱交流的开放平台以丰富自己的参考数据库，MALDI－TOF MS系统的灵活性更有利于它在各领域的应用。

2 MALDI－TOF MS相比传统方法的优势与局限性

2.1 MALDI－TOF MS的优势 目前，病原菌的鉴定方法分为两大类：表型鉴定法和基因型鉴定法，前者是微生物鉴定的传统手段。传统鉴定方法可根据实际情况优先选择试验项目，其灵活性高、成本较低、易于操作，至今仍在医院中广泛应用，但鉴定周期较长（24～72h左右）、依赖性强、对实验人员的专业素养要求较高，对一些疑难细菌的鉴定能力较为薄弱。而以基因型为主的鉴定方法，虽能从遗传学及种系角度来对病原菌进行鉴定分类，但因为其专业性强、所需试剂和仪器昂贵等缺点，未能在各级别医院中广泛应用。和临床微生物鉴定的常规方法（例如API微生物鉴定条、VITEK 2全自动微生物分析系统）相比，尽管MALDI－TOF MS设备技术高端，但使用简单，十分易于操作。

由于每种微生物都有其独特的蛋白质组成，与传统方法依靠微生物生理生化特性不同，蛋白质组成很少受到环境条件的影响，主要由遗传特性所决定，因此MALDI－TOF MS更加准确与可靠。在众多的方法之中，MALDI－TOF MS的一个主要优点是其鉴定微生物的普遍性。它可以同时分析大量目标且不要求选择特定的识别抗体或引物，而对发生基因变异的微生物，MALDI－TOF MS至少可以把他们鉴定到最近的邻居数据库中。利用MALDITOF MS，单个样品的分析在30s之内就可以完成，把维护和待机的时间考虑入内，一台仪器每天可以分析超过1 000个样本。通过把样品制备过程自动化还可以进一步提高效率。MALDI－TOF MS已在直接鉴定尿液标本上取得成功，J Laura Ferreira等人[1]的研究结果表明，利用 MALDI－TOF MS可以在短时间内直接从尿液中鉴定出细菌，这种方法精度高，尤其适合革兰阴性菌高度参与的情况下。对于菌血症，应用MALDI－TOF MS以血培养材料直接进行菌种鉴定被证明能显著降低诊断时间（小于29h），使得在血培养阳性的第1个24h内接受适当抗生素治疗的患者增加11%[2]。这对传统鉴定方法而言是不可能完成的。

MALDI－TOF MS能以最少量的样品来快速测定蛋白质的分子量。这种全新的、简单的方法大大地降低了耗材成本和鉴定诊断时间。通过成本计算，MALDI－TOF MS的花费要低于常规的生化鉴定方法。随着微生物的快速诊断，过去住院时间延长带来的开销和昂贵的经验性药物治疗费用将显著减少。其可靠性和准确性已在多个研究报告中得以证明，不同的系统设备已在市场销售。目前，拥有MALDI－TOF MS的有四家商业系统：the MALDI Biotyper（布鲁克·道尔顿，德国不来梅），AXIMA＠SARAMIS数据库（AnagnosTec，德国波茨坦和岛津，德国杜伊斯堡），以及最近的Andromas（Andromas，巴黎，法国）和VITEK MS系统（生物梅里埃，法国）[3]。在临床上尚未使用大量样本对这4种商业系统进行评估比较，但已有研究表明MALDI Biotyper系统和VITEK MS系统鉴定能力相当[4]。

区分表型不同的亚种将会是MALDI－TOF MS运用于微生物诊断学的一个新思路。MALDI－TOF MS已经能够用于区分鉴定双歧杆菌和弗兰克氏菌的固氮菌株的新亚种。在一项研究中[5]，研究者发现MALDI－TOF MS能够区分 和近平滑念珠菌中的有生物膜和无生物膜的两种亚型。最近对沙门氏菌[6]，无乳链球菌、土拉弗朗西斯菌[7]、脆弱拟杆菌[8]、鲍曼不动杆菌[9]和小肠结肠炎耶尔森菌[10]的研究证明MALDI－TOF MS能在亚种水平上对它们进行鉴定。

在耐药菌株检测方面，MALDI－TOF MS正在探究关于β－内酰胺酶活性的检测[11]。如通过检测碳青霉烯类抗生素及其降解产物，可以有效地鉴定样本是否为碳青霉烯类耐药菌株[12－13]，此方法大大缩短了检测时间，是很有前景的检测方法。Marie Kempf[14]等人的实验第一次表明 MALDI－TOF MS可以用来快速准确地发现产碳青霉烯酶的鲍曼不动杆菌，以防止超级细菌不可控地爆发与传播。

2.2 MALDI－TOF MS的局限性 MALDI－TOF MS被越来越多地应用到微生物分类上，例如，Munoz等，利用 MALDI－TOF MS揭示了高盐环境中嗜盐细菌的生物多样性，筛选识别出潜在的新物种。然而目前，MALDI－TOF MS并不能为某一特定菌株定义一个具体的分离该物种的阈值，因为即使同一种属的微生物亦存在变化，所以常用与参考数据库比较而得的效值作为鉴定结果。如使用MALDI Biotyper 2.0software时，当分值≥2时表示待测菌株被鉴定到种水平；分值在1.7和1.9之间时；表示被鉴定到属水平，分值＜1.7时表示鉴定失败。

另外，虽然MALDI－TOF MS已用于种水平上的区分鉴定，但对不同类群物种复合物中的亚种进行区分仍有不少局限性。现阶段对于潜在亚种的分类鉴定是有限的，样品的进一步准备、数据分析的新方法及数据库的不断完善可能可以增加MALDITOF MS的分辨率水平。

虽然MALDI－TOF MS已能成功检测碳青霉烯类耐药菌株，但检测其他细菌耐药性机制的能力仍受限。早前已有研究表明MALDI－TOF MS能用于细菌耐药性的检测，然而现在大多数检测依旧处在实验阶段。有研究人员使用MALDI－TOF MS快速检测与MRSA耐药机制密切相关的青霉素结合蛋白2a（Penicillin－binding protein 2a，PBP2a）。一些实验发现甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（Methicillin－sensitive Staphylococcus Aureus，MSSA）和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin－esistant Staphylococcus Aureus，MARS）菌株蛋白质谱之间存在差异，可所检测到的差异不是由于PBP2a引起，而是由于金黄色葡萄球菌株的克隆性所致。所以MALDI－TOF MS可对来自不同病区或同一病区的不同病人MRSA的克隆来源进行区分，但不能正确地区分 MRSA和 MSSA。另外，由于 MALDITOF MS的质量检测范围（2～20kDa）限制以及数据库的缺乏，对于真菌耐药性检测仍在探索中。相信随着MALDI－TOF MS技术的发展，其在病原菌的耐药监测方面会有更大的突破。

有研究已评价了使用MALDI－TOF MS分析混合样品，鉴定各组成部分的能力。虽然通常2种或3种细菌存在于样品中的数量类似时，各组分可以被分离和确定，但当混合物中某一个物种数量占强烈主导地位时，MALDI－TOF MS的鉴定能力明显受限。另外，限制MALDI－TOF MS使用的另一个问题来自于人体质谱信号的干扰，无法直接检测来自人体无菌部位的样品（如血液、脑脊液等标本）。血液中的血红蛋白、白蛋白和血培养基中的活性炭等物质会干扰菌株本身的质谱，所以需要额外的净化提取步骤。目前已尝试使用不同方法如差速离心或吸收干扰物质等使得样品能直接用于MALDITOF MS检 测[15]。Olivier Clerc[16]等 人 认 为 基 于MALDI－TOF MS对血培养阳性标本的鉴定可能会成为血培养阳性病人管理中除了革兰氏染色报告之外的第2个关键步骤。但尚未出台规范化的标准程序且MALDI－TOF MS用于直接鉴定时仍存在不少问题。Chen JHK等人[17]的研究表明 MALDI－TOF MS可以直接鉴定血培养阳性的标本，但亦存在革兰阳性细菌的鉴定率比革兰阴性细菌低；荚膜细菌如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和肺炎克雷伯菌的鉴定率比其他无荚膜细菌低；细菌量不足或混合感染时鉴定率低；培养物其他成分严重影响结果分析等问题。另外，MALDI－TOF MS虽然已经可以用于直接鉴定尿液标本，但目前对含有两种以上细菌感染的尿液标本，MALDI－TOF MS常不能正确鉴定[18]。

目前来看，MALDI－TOF MS在对病原菌亚种上的鉴定、病原菌的耐药检测、人体无菌部位样品的直接鉴定以及混合病原菌物种的鉴定方面仍有局限性。

3 MALDI－TOF MS与传统方法的鉴定效率比对

实验室研究发现 MALDI－TOF MS对于奈瑟菌、梭状芽胞杆菌、沙门氏菌、草绿色链球菌、幽门螺旋杆菌和弯曲杆菌等的鉴定准确率几乎为100%。对于单核细胞增生李斯特氏菌、厌氧菌、拉乌尔菌、气球菌、乳球菌、隐秘杆菌、泛菌属、阪崎肠杆菌和结核分枝杆菌等，与传统方法相比 MALDI－TOF MS更有优势。甚至对于某些传统鉴定方法和基因型手段来说都棘手的物种，如洋葱伯克霍尔德菌复合物，MALDI－TOF MS也可以区分[19]。目前对于核糖体蛋白序列没有足够差异的物种，如志贺氏菌属和大肠杆菌或肺炎链球菌（肺炎球菌）和缓症链球菌／口腔链球菌不能通过MALDI－TOF MS来区分（有研究表明[20]梅里埃的VITEK MS可以区分肺炎链球菌和缓症链球菌／口腔链球菌），此时经典生化试验、抗原检测或分子生物学方法是必需的。

传统的表型鉴定方法往往只能鉴定出常见的念珠菌种属，而已有研究证实MALDI－TOF MS能够快速、准确地对常见和不常见的念珠菌种属进行鉴定。MALDI－TOF MS在鉴定酵母方面有较高的鉴定率[21]。最近有文章[22]指出由表型鉴定方法初步鉴定为无名假丝酵母的菌株被基因型方法鉴定为季也蒙念珠菌、鲁希特念珠菌、发酵型念珠菌、中间念珠菌和抗草甘膦真菌。此结果表明无名假丝酵母可能作为侵袭性真菌病因的机会并不似以前报道的那么多。以传统表型鉴定方法鉴定为无名假丝酵母是不可靠的，而 MALDI－TOF MS的准确度要高很多[23]。McTaggart LR 等 人[24]的 研 究 指 出 MALDI－TOF MS对隐球菌的鉴定准确率可达100%。然而对于丝状真菌，因为首先其常可表现出完全不同的表型，且被分析的蛋白质质谱可能依赖于其生长条件或真菌菌丝体的区域；其次，丝状真菌中蛋白质的提取操作缺乏标准化；另外，目前市售的设备中包含的数据库很少有其参考光谱。所以关于利用MALDI－TOF MS鉴定临床微生物学有关的常规丝状真菌的前瞻性研究尚未公布。但一些研究已经显示了MALDI－TOF MS鉴定临床真菌的潜力，如曲霉属，青霉属，镰刀菌或各种皮肤癣菌。但这些研究的建立和使用依赖于自己的参考光谱数据库和（或）使用严格控制的预分析步骤（如孵化培养基及持续的时间）。随着数据库的不断完善和提取步骤的优化，MALDI－TOF MS会成为优于鉴定丝状真菌传统方法的更高效的鉴定方法。

当MALDI－TOF MS与传统生化鉴定方法得出结果不一致时，采用基因型鉴定方法进行分析得出的结果往往与MALDI－TOF MS的一致。高质量的MALDI－TOF MS与基因型鉴定方法拥有同样出色的鉴定能力。

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