蛋白质组学在肥胖和胰岛素抵抗及2型糖尿病中的应用研究进展

王铭婕，闫朝丽

肥胖、胰岛素抵抗和2型糖尿病作为糖尿病发生的三步曲，关系十分紧密。目前得到大家认可的蛋白质组学已经运用在动物细胞、组织成为一种新兴的技术手段，而应用于肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病患者的血清、组织细胞甚至唾液和尿液的蛋白质相关分析更加直观，临床指导作用更强。进一步在蛋白水平上揭示肥胖、胰岛素抵抗及2型糖尿病之间的关系，为解释疾病发生发展机制、预防和诊断2型糖尿病以及糖尿病相关药物的开发提供思路。本文就蛋白质组学在肥胖、胰岛素抵抗及2型糖尿病中的应用及进展作一综述。

1 蛋白质组学概述

蛋白质组(proteome)的概念首先由澳大利亚学者Wilkins等于1994年首次提出，源于蛋白质(protein)和基因组的(genome)的整合，指一个细胞内存在的全部蛋白质[1]。蛋白质组本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰、蛋白与蛋白相互作用等，由此整体而全面地认识蛋白质水平上关于疾病发生发展的过程。目前蛋白质组学研究较多使用双向电泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)和质谱法(mass spectrometry，MS)。

2-DE是等电聚焦电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)的组合，即先进行等电聚焦电泳(按照pI分离)，然后再进行SDS-PAGE(按照分子大小)，经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。MS即用电场和磁场将运动的离子按质荷比分离后进行检测的方法，目前多用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)，主要用于对生物大分子物质和有机小分子化合物分子量的测定以及对蛋白质进行高通量的鉴定。

2 蛋白质组学的应用

蛋白质组学作为大规模水平上蛋白质筛查的方法，可鉴定出大量蛋白质，但是目前对其中的一部分蛋白质认识甚少，还需要在确定其种类的基础上对其功能学及与疾病的关系深入了解。从下文可知，同时发现的大量差异蛋白具有共同的生理或病理作用，因此可作为相关联的一组蛋白群整体研究。由于肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病不是完全分隔开的几个阶段，本文根据研究对象所处的主要病理状态进行分类表述。

2.1 蛋白质组学与肥胖 糖尿病的危险因素主要有糖耐量受损、家族史和肥胖，其中肥胖是2型糖尿病的最重要诱因之一[2]。鉴于肥胖人群中糖尿病的高发病率及当今肥胖的高流行，找到肥胖对糖尿病的诱发机制十分必要，其机制的明确将为肥胖型糖尿病的预防和控制提供新的思路。

Brockman等[3]经MS鉴定出的14-3-3在肥胖早期小鼠脂肪组织表达上调，肽基脯氨酰顺反异构酶Pinl在肥胖小鼠脂肪组织表达下调，这可能与其细胞增殖、分化和保护作用相关。噻唑烷二酮(thiazolidinediones，TZD)是过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)的激动剂，已经证明TZD可以恢复脂肪细胞相关功能障碍，如炎症活动和胰岛素抵抗。Chen等[4]用MALDI-TOF-MS分析有无TZD治疗的肥胖大鼠的内脏脂肪组织，通过液相色谱及MS证明，利用TZD治疗12 d后，77种蛋白质水平发生改变，包括炎性分子、细胞外基质蛋白质、胶原蛋白和免疫因子等，这些蛋白质可能具有改善脂肪细胞功能的作用，从而得出TZD治疗可以提高胰岛素敏感性的结论。Tvarijonaviciute等[5]利用2-DE对比格犬控制体质量前后的血清蛋白组学进行分析，绘制出肥胖组和消瘦组的蛋白图谱，对比显示有3个点存在差异，鉴定后得到视黄醇结合蛋白4、凝聚素的前体表达上调，抗胰蛋白酶1表达下调。凝聚素作为载脂蛋白对血脂的调节有重要影响，而视黄醇结合蛋白4作为新近发现的一种脂肪因子，其升高与胰岛素抵抗、肥胖及多种心血管危险因子密切相关。王俊等[6]利用游离胶分馏器(OFFGEL)电泳-差异蛋白质组学的方法对肥胖亚型、非肥胖亚型糖尿病患者组和对照组分别鉴定出391、415、371 种差异蛋白，结果表明脂联素在肥胖亚型糖尿病患者血浆中低表达，基质交感分子1 (stromal interaction molecule 1，STIM1) 在肥胖亚型糖尿病患者血浆中高表达。STIM1是钙库操控钙通道(store-operated channels，SOC)的感受器，通过调控钙库，操控钙内流，补充细胞内钙离子浓度。在糖尿病及肥胖患者体内钙离子水平表现出细胞内高钙而体钙缺乏，这可能与STIM1高表达有关；丝氨酸蛋白激酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶等6种蛋白激酶在非肥胖亚型糖尿病患者血浆中高表达。脂联素、STIM1和一系列蛋白激酶在肥胖亚型、非肥胖亚型糖尿病的发病机制上可能存在差异。

Bae等[7]利用2-DE-差异蛋白组学研究发现在肥胖者的胰岛素敏感组织如肝脏、骨骼肌和脂肪组织中存在大量的差异蛋白，其中白细胞共同相关抗原磷酸酶、蛋白酪氨酸磷酸酶α( protein tyrosine phosphatase α，PTP-α)、蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B，PTP-1B)均有高表达，后续研究证明这些酶参与胰岛素信号转导。Kim等[8]利用2-DE分析肥胖人群血浆，并用酶联免疫吸附试验进行验证，结果表明在肥胖人群中血浆铜蓝蛋白和纤维蛋白原水平明显升高，且与肥胖程度呈正相关。Insenser等[9]选取了6例病态肥胖患者及6例正常人的皮下组织及内脏脂肪组织，利用2-DE和MALDI-TOF-MS对其进行分析，结果显示羧酸酯酶-1、14-3-3等蛋白水平在肥胖患者中增高，补体C3、纤维蛋白原C链、清蛋白、α1-抗胰蛋白酶和过氧化物酶6等下降。Oliva等[10]对糖耐量正常的肥胖和正常孕妇剖宫产后的胎盘蛋白进行研究，结果显示肥胖患者的人膜联蛋白A5、ATP合酶β亚基、脑酸溶性蛋白1(brainacidsolubleprotein 1，BASP1)、铁蛋白轻链、波型蛋白降低，α-1-抗胰蛋白酶、葡萄糖调节蛋白75(glucose-regulated proteins 75，GRP75)升高。这些蛋白质在调节生长、构建细胞骨架、氧化应激、炎症、凝血和凋亡中发挥作用，其改变可能对胎儿的生长发育有重大影响。上述研究均利用非定向蛋白组学方法找出了正常人与肥胖患者间大量的新型差异蛋白，并推测这些蛋白可能与肥胖的发展有关。

2.2 蛋白质组学与胰岛素抵抗 胰岛素抵抗指一定量的胰岛素与其特异性受体结合后所产生的生物效应低于正常。表现为外周组织尤其是肌肉、脂肪组织对葡萄糖摄取减少及胰岛素抑制肝葡萄糖输出的作用减弱[11]。胰岛素抵抗的发生、发展是多因素、多基因及多阶段的复杂过程，用蛋白质组学策略从整体水平来探讨胰岛素抵抗的发生与发展规律，为研究者提供了预防和治疗糖尿病的思路。

Lim等[12]为了增加准确度，利用单向电泳和2-DE两种方法找到差异蛋白，平行进行MS，比较胰岛素抵抗大鼠与正常大鼠脂肪细胞中的蛋白质，差异蛋白包括补体C6、金属蛋白酶组织抑制物1、组织蛋白酶B、脂蛋白、硫氧还原蛋白、凝溶胶蛋白等，均参与了免疫反应、细胞外组织重塑和氧化应激。Kameji等[13]研究发现，存在氧化应激和胰岛素抵抗的小鼠脂肪细胞中，肿瘤坏死因子α水平升高；Yan等[14]发现茶中的儿茶素可以减少血清中的肿瘤坏死因子α水平，从而衰减活性氧的产生和缓解胰岛素抵抗。

Giebelstein等[15]利用2-DE及高效液相色谱与MS联用技术分析胰岛素抵抗患者的骨骼肌，结果表明糖酵解酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸葡萄糖变位酶2、骨骼肌烯醇化酶和丙酮酸激酶等的水平明显高于正常人，与上述糖酵解酶水平增加相反，线粒体蛋白烯酰基辅酶A异构酶水平减少，表明糖酵解酶的增加和线粒体蛋白的减少可能导致胰岛素抵抗和2型糖尿病。

2.3 蛋白质组学与2型糖尿病 糖尿病是由胰岛素分泌异常和/或胰岛素活性异常所导致的一种代谢疾病，此疾病会引起伴随糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱的高血糖症状[16]。作为引起疾病的主要标志物或作为由疾病引起的继发效应，蛋白质水平的变化对疾病的研究意义重大。

2.3.1 组织中的蛋白质组学研究 Mullen[17]应用2-DE技术研究了正常大鼠与糖尿病GK大鼠腓肠肌线粒体中的蛋白质，发现烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶、细胞色素b-c1复合物、异柠檬酸脱氢酶等蛋白在内的线粒体标志蛋白在糖尿病模型GK大鼠中表达量均显著降低。Han等[18]利用放射性核素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative andabsolute quantitation，iTRAQ) 技术在肥胖大鼠、肥胖糖尿病大鼠以及正常大鼠的胰岛组织中进行研究，在肥胖糖尿病大鼠与正常大鼠的比较中发现54个差异蛋白，在肥胖大鼠与正常大鼠之间发现58个差异蛋白，并且首次发现了一些与胰岛素损伤、线粒体功能紊乱、细胞外基质蛋白、微血管缺血相关的蛋白质。Essop等[19]分离出18～20周雌性db/db鼠心脏组织中的线粒体研究发现ATP合酶D链、辅酶细胞色素C还原酶核心蛋白1和电子转移黄素蛋白亚基α水平增高，α平滑肌肌动蛋白、α心肌肌动蛋白、肌球蛋白重链α和肌球蛋白结合蛋白C水平下降，以上蛋白水平的改变可能与心脏收缩功能下降有关，从而引起糖尿病大血管病变等相关并发症。Zhang等[20]利用2-DE和MS对患有2型糖尿病肾病的db/db鼠肾脏进行研究，db/m鼠作为对照组。经对比及鉴定发现，天冬氨酸酰酶3、环氧化物酶2、D-乳酸脱氢酶、蛋白激酶C抑制剂蛋白1、E钙黏蛋白丰度下降，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)的第2合成酶(HMGCS2)、线粒体酰辅酶A合成酶2、醛缩酶B亚型2、波形蛋白、免疫球蛋白重链V类似物丰度上升，上述蛋白可能与增强上皮细胞-间充质转分化有关，上皮细胞-间充质转分化会导致肾小管上皮细胞重塑为成纤维细胞，失去原有功能。HMGCS2是生酮作用中的关键酶，其增加表明2型糖尿病患者肾脏具有高于常人的生酮作用。总的来说，这些研究结果表明糖尿病肾脏具有多余的生酮活动，糖尿病肾病中增强的酮体生成作用可能为一种新的糖尿病肾病的发病机制。

Murri等[21]对单纯肥胖者与2型糖尿病伴肥胖者的脂肪组织进行对比研究，糖尿病患者谷胱甘肽S转移酶μ2、过氧化物酶、抗凝血酶Ⅲ、载脂蛋白A-Ⅳ、免疫球蛋白κ链C区、线粒体醛脱氢酶和肌动蛋白丰度增加，膜联蛋白-A1、醛脱氢酶1、黏着斑蛋白丰度下降，这些蛋白参与了细胞骨架的功能和结构、氧化应激、炎症和类视黄醇代谢，将来在2型糖尿病的发展以及功能障碍的研究中，这些蛋白质可以发挥候选分子的作用。Hwang等[22]分析正常人、单纯肥胖患者以及2型糖尿病患者的骨骼肌蛋白质，结果显示92个蛋白点与胰岛素抵抗有关，其中15个点具有明显的丰度变化，如TCP-1亚基、蛋白水解酶复合体水平增加，结蛋白和α辅肌动蛋白2水平下降，结果证实在胰岛素抵抗的肌肉中线粒体数量减少，蛋白质降解，肌肉结构改变。

2.3.2 血液中的蛋白质组学研究 Takahashi等[23]利用iTRAQ技术，对2型糖尿病KK-Ay鼠血清进行研究，确定了8种蛋白存在变化，其中补体因子B、载脂蛋白A-Ⅱ、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3K(Serpina3k)、血纤维蛋白溶酶原等水平明显升高。在体外实验发现，人类视网膜微血管同源性Serpina3k能够增加跨内皮通透性，这可能与糖尿病和/或糖尿病视网膜病变的发病机制相关。

Lu等[24]比较确诊时间少于5年且合并视网膜病变的2型糖尿病患者与确诊时间超过10年但未出现视网膜病变的2型糖尿病患者的血清蛋白质组，确定了77个血浆差异蛋白，其代表28个独特的基因产物，其中生育酚结合蛋白(afamin)、α1-抗胰蛋白酶、载脂蛋白E、结合珠蛋白等水平下降；抗凝血酶Ⅲ、纤维蛋白原α、激肽原1、锌-α-2-糖蛋白等水平上升，这些蛋白质主要参与炎性反应和凝血作用。作者认为利用该方法确定的几个蛋白质可以作为潜在的糖尿病性视网膜病的生物标志物，与糖尿病的进展有关。

2.3.3 其他体液中的蛋白质组学研究 Zürbig等[25]运用毛细管电泳-电荷耦合质谱法分析了正常人、新发糖尿病及糖尿病肾病进展期患者尿中的低分子量蛋白质，结果显示胶原蛋白片段、免疫球蛋白受体聚合、CD99抗原、尿调节素(在内质网中产生，最后通过蛋白酶水解切割释放到尿液中，能够阻碍肾结石和尿路感染发生)等在糖尿病肾病进展期患者的尿液中水平均下降，间接证明上述蛋白与糖尿病肾病的发生发展有关，可以作为预测糖尿病肾病的生物标志物，在早期阶段通过非侵入性方法对糖尿病肾病进行风险评估。Riaz等[26]收集了100例性别相同、年龄相似、病情发展程度相当的2型糖尿病患者及正常对照组的尿样，运用二维分析液相色谱仪(一维色谱聚焦，二维反相色谱法)和MS发现2型糖尿病患者中转甲状腺素蛋白、人α1微球蛋白/bikunin前体蛋白、结合珠蛋白前体水平减少；清蛋白、锌-α-2-糖蛋白、视黄醇结合蛋白4、人钙黏附蛋白水平下降，上述蛋白的发现不仅在早期诊断，而且在评估2型糖尿病的预后方面都将有帮助。Paasch等[27]收集1型糖尿病患者、2型糖尿病患者、单纯肥胖患者和健康人的精液，对其中的精子细胞运用2-DE进行分析，结果显示与健康人相比，其他3组共有79个蛋白点存在明显变化。MS鉴定，1型糖尿病组有12种蛋白水平发生变化，2型糖尿病组有71种，单纯肥胖组有13种。1型糖尿病组和2型糖尿病组精囊蛋白、簇集蛋白、乳铁蛋白显著增加；β-半乳糖苷酶-1样蛋白是惟一的在3个病理情况下均被检测到下降的蛋白质，前3种蛋白质是附睾蛋白酶(EPPIN)抑制剂复合物的组成部分。EPPIN被认为具有完成受精相关的功能作用，如射精、精子的保护，运动能力的调节和增强顶体反应；β-半乳糖苷酶-1样蛋白作为糖基水解酶蛋白质，其功能与精子成熟有关。

3 现状与展望

使用2-DE凝胶技术为基础的方法对蛋白质进行研究已经广泛开展，其缺点为研究结果的重现性和敏感度有限。MS敏感度高，可靠性强，但是不适宜大量蛋白质的快速鉴别[28]。此外，对于肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病系列的蛋白质组学研究仍存在局限性，目前的研究几乎都仅限于筛选差异蛋白质，而功能研究还不是很深入，对各种差异蛋白相互作用的研究更少。

未来对肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病系列的蛋白质组学研究主要在以下几方面存在挑战：(1)丰度极低的蛋白质变化非常小，当前的蛋白质组学工具很难检测到。但这些低丰度蛋白质或小的变化，可能对维持细胞正常功能起到非常关键的作用，也可能是关键的功能调控机制。(2)信息快速调节蛋白的分泌和信号转导调控是一个动态过程，甚至是一过性的，及时地针对性蛋白动态捕捉技术仍有待研究。(3)多种蛋白质作为一组蛋白的贡献是相互关联的，对其进行系统研究能够更好地理解作为一个功能整体对健康和疾病的影响。(4)就目前来看，研究的成本过于昂贵。

对于糖尿病，可以在细致分类的基础上进行有无差异蛋白-差异蛋白鉴定-蛋白功能、相互作用及影响-药物靶向治疗的纵向研究，揭示这些蛋白质在2型糖尿病发病过程中扮演的角色，为了解2型糖尿病的发病机制、鉴定疾病的分子标志物、针对性治疗提供新的途径和思路。

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