寄生虫乳酸脱氢酶研究进展

王艳歌，董 辉，黄 兵

（中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点实验室，上海 200241）

寄生虫乳酸脱氢酶研究进展

王艳歌，董 辉，黄 兵

（中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点实验室，上海 200241）

大多数体内寄生虫的生存必须依赖糖酵解途径将葡萄糖代谢为乳酸以提供能量。乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）是糖酵解途径的末端酶，催化丙酮酸还原为乳酸及乳酸氧化为丙酮酸的可逆反应，与寄生虫生存密切相关。研究表明，各种寄生虫LDH在理化性质和分子结构方面均有独特的特性，是良好的诊断分子和潜在的药物作用靶标。对寄生虫LDH功能的研究，对于促进寄生虫病诊断、疫苗研究以及新抗虫药物的研发具有重要意义。本文对国内外寄生虫LDH的研究现状进行了综述。

乳酸脱氢酶；寄生虫；诊断；药物靶标；疫苗

乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）是广泛分布于微生物、植物和动物细胞内的一种重要功能酶，是生命活动中最重要能源物质“糖”无氧酵解途径的关键酶之一。大多数体内寄生虫的能源主要来源于无氧糖酵解途径，LDH是该途径的末端酶，在NADH和NAD+的辅助下，催化丙酮酸与乳酸之间的可逆反应，释放能量供机体所需。LDH一旦被抑制，将导致虫体发育停止甚至死亡。已有研究表明，寄生虫LDH是良好的诊断分子及潜在的药物作用靶标。鉴于寄生虫LDH的重要功能和作用，国内外对该酶进行了一系列研究，主要集中在基因特性、蛋白特性、药物筛选、免疫诊断等方面，本文对国内外寄生虫LDH的研究现状进行了综述。

1 原虫LDH

1.1 疟原虫LDH（PlasmodiumLDH, PLDH）在基因特性方面，江莉等[1]对间日疟原虫（P. vivax，Pv）和恶性疟原虫（P. falciparum, Pf）LDH基因的序列进行了研究，发现编码区全长均为951 bp，编码316个氨基酸，核苷酸和氨基酸序列的同源性分别是75.1%和90.2%；特异性表位分别为38个和45个；两种虫体的LDH抗原对多克隆抗体最高抑制率，Pv可达70.3%，而Pf仅为30.5%。Brown等[2]对人体4种PLDH基因进行了研究，发现恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫（P. ovale, Po）以及三日疟原虫（P. malariae, Pm）LDH的氨基酸序列有90%～92%的一致性，PLDH序列与宿主LDH差异明显，相似性仅为28%～30%，具有种、属特异性。Winter等[3]在4种PLDH底物特异性环上发现含有相同的5个氨基酸插入序列（SDKEW），这种特异性插入片段除在刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）LDH有相同结构外，尚未在其它种属发现，是一个重要的药物靶标。

在诊断方面，由于PLDH是虫体普遍存在的一种重要循环抗原，且具有种、属特异性，在疟疾诊断上有重要的应用价值[4]。汪俊云等[5]和孙莉等[6]分别成功制备了PfLDH和PvLDH的单克隆抗体，为研究疟疾诊断试剂盒奠定了基础。Wu等[7]用PfLDH单克隆抗体制作胶体金免疫层析试纸条，建立了一种快速、简捷并特异检测恶性疟原虫的方法。李雪峰等[8]评估疟疾乳酸脱氢酶单克隆抗体快速检测试剂在疟疾诊断和鉴别诊断上的特异性和敏感性，发现OptiMal-IT金标层析法是一种快速、简便、特异性强、敏感性高的疟疾诊断和鉴别诊断试剂，可用于快速应急检测疟疾。

在药物标靶方面，现有研究发现PLDH与宿主LDH在生化、免疫学特性和酶学方面有很大差异，被认为是潜在的药物靶标[9]。鉴于PLDH在疟原虫能量代谢中的重要性及其与宿主LDH活性位点结构上的差异，国内外学者对能够抑制PLDH活性的药物进行了研究，发现多种药物能与PLDH发生作用。据Read等[10]和Menting等[11]报道，抗疟疾药物氯喹（Chloroquine）能够竞争性地结合在LDH上的NADH结合位点，占据了与辅酶腺嘌呤环相似的位置，阻止NADH与LDH的相互作用，切断糖酵解途径，从而引发疟原虫的死亡。棉酚（Gossypol）具有很强抗疟疾作用，其作用机理是特异性地抑制PLDH的活性，阻断虫体内的能源供应，但其毒副作用太大，至今尚未作为抗疟疾药物[12]。Camerun等[13]研究发现，在低于抑制人LDH活性所需浓度100倍的情况下，吡咯类化合物（Pyrrolic nitrogen compounds）对PLDH有选择性抑制作用，晶体结构分析显示这些竞争性抑制剂作用于酶活性位点的氨基酸，沿NAD烟酰胺环堆积，提示该类化合物有可能成为治疗疟疾的新药。对硫代吖啶酮（Thioacridone）、血红素（Heme）、萘类化合物（Naphthalene compounds）等药物的研究，也证实了这些药物对PLDH有不同程度的抑制作用[14,15]。

1.2 弓形虫LDH（ToxoplasmaLDH，TLDH）LDH是弓形虫分化所必需的酶，在碱性条件下，LDH的上调表达，可增加弓形虫的分化[16]。LDH的缺失，可导致慢性感染中不能形成严重的脑包囊负荷，使弓形虫的致病性减弱[17]。弓形虫可在中间宿主体内进行速殖子与缓殖子之间的转换，已发现在其不同发育阶段表达2种LDH（TLDH1、TLDH2），预测的分子量分别是35.5 kDa和35.3 kDa，核苷酸和氨基酸序列的相似性分别为64.0%和71.1%。TLDH2在缓殖子内表达，而TLDH1在缓殖子及速殖子内均有表达，但不同发育阶段只有其中一种LDH表达，提示TLDH的表达水平与弓形虫虫期转换以及碳水化合物或能量代谢转变之间有一定关联[18]。TLDH2在底物特异环上也有与PLDH一样的KSDKE插入片段，与TLDH1的KPDSE略有不同。但TLDH1和TLDH2具有比PLDH更广泛的底物特异性，两者也能被抑制PLDH活性的一些化合物如棉子酚及其衍生物（gossypol derivatives）、二羟基萘芬酸（dihydroxynaphthoic acids）等所抑制。虽然对底物抑制起关键性作用的辅酶结合位点的氨基酸相同（163M），但TLDH1具有底物抑制性，而TLDH2与PLDH一样，无底物抑制性[19]。

1.3 球虫LDH（EimeriaLDH）每种球虫仅有一种LDH，堆型艾美耳球虫（Eimeria acervulina）、巨型艾美耳球虫（E. maxima）和柔嫩艾美耳球虫（E. tenella）LDH基因的开放阅读框大小分别是993 bp、993 bp和996 bp，分别编码330个、330个和331个氨基酸，三者氨基酸的同源性为66%～80%，球虫LDH聚合成同源四聚体才具有活性，其蛋白在卵囊、子孢子、裂殖体和裂殖子阶段的表达水平相当，但其RNA转录仅在裂殖生殖阶段发现，表明其合成局限于厌氧的细胞内阶段[20]。宋鸿雁[21]构建了堆型艾美耳球虫LDH的DNA疫苗，动物保护性试验和免疫机理研究证实，该DNA疫苗可诱导机体产生细胞免疫和体液免疫，共同参与抵抗球虫感染，为机体提供一定保护力。

LDH在球虫种内虫株之间变异也较大，是有用的遗传学标记。黄兵等[22]用聚丙烯酰胺凝胶电泳对5种鸡球虫同工酶研究，结果表明不同种类球虫之间的LDH同工酶酶谱存在明显差异。余丽芸等[23]发现柔嫩艾美耳球虫耐药虫株的LDH酶谱为2条带，敏感虫株为3条带，耐药株比敏感株缺少LDH-2。张祝明等[24]研究发现与柔嫩艾美耳球虫敏感株相比，抗磺胺氯吡嗪（Sulfaclozine）耐药株有1条特异性的LDH条带。郭涛等[25]采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对不同耐药株LDH同工酶进行了分析，发现敏感株有一条浓带，而地克珠利（Diclazuril）抗药株无酶带。药物对敏感株有效，对耐药株完全无效，而敏感株与耐药株之间的LDH电泳条带明显不同，提示球虫LDH与药物发挥抗球虫作用可能具有密切关系。

1.4 隐孢子虫LDH（CryptosporidiumLDH）郭志云等[26]成功克隆微小隐孢子虫（C. parvum, Cp）南京株LDH基因，该基因全长有966 bp，编码322个氨基酸，与国外分离的Iowa II株LDH基因编码的氨基酸序列有98%的一致性，在关键结构位点存在突变。Madern等[27]表达微小隐孢子虫L-乳酸脱氢酶(L-LDH1) 和 L-苹果酸脱氢酶(L-MDH1) 基因 ，并对顶器复门原虫LDH和MDH数据库进行进化关系分析，证实早期假说，CpLDH1可能与CpMDH1从共同的祖先进化而来。

2 吸虫LDH

2.1 日本血吸虫LDH（Schistosoma japonicumLDH，SjLDH）刘传爱等[28]成功获得了日本血吸虫LDH基因的全长cDNA序列，其全长有1251 bp，编码331个氨基酸。Lv等[29-33]对日本血吸虫LDH基因的抗原特性以及酶学特性进行了研究，结果表明，该基因编码的蛋白大小约36 kDa，其重组蛋白具有很好的免疫活性，重组蛋白酶活性是379U/mg，正逆反应的最佳pH分别为pH6.0～7.0和pH9.0～10.0，最佳温度分别为37～60 ℃和40～50 ℃，重组蛋白催化正反应的效率高于逆反应，表明重组蛋白在生理条件下主要催化正反应。生物信息学预测结果提示LDH是研究物种分子进化理想的分子，是免疫诊断、药物作用及疫苗研制的潜在靶分子。药物抑制试验结果表明，血红素、Fe3+对重组日本血吸虫LDH的活性有极强的抑制作用。Xiao等[34]对感染日本血吸虫的小鼠注入100～300 mg/kg 青蒿素（Artemisinin），24～72 h 后检测LDH的活性，试验表明，青蒿素因抑制了SjLDH活性而使乳酸的生成减少。

2.2 华支睾吸虫LDH（Clonorchis sinensisLDH,CsLDH）胡文庆等[35]对华支睾吸虫5个虫龄期（10、20、30、60、90 d）的LDH同工酶进行了检测，结果60 d、90 d虫龄期的LDH-5相对浓度增加。Yang等[36]从成虫cDNA文库中筛选出了LDH基因，该基因全长1230 bp，编码328个氨基酸，预测蛋白大小为35.6 kDa。酶活及酶抑制剂研究表明，CsLDH是一个潜在的药物靶标。胡旭初等[37]分析CsLDH基因及其编码蛋白的结构和特性，推测该酶不仅催化糖酵解过程的丙酮酸与乳酸间的可逆反应，而且能把乳酸直接排出体外，可作为筛选抗华支睾吸虫新药物的靶标，亦可介导特异性抗体对虫体的ADCC作用和补体的杀伤作用，以及对酶活性的抑制作用，是一个重要的疫苗候选抗原。黄灿等[38]成功克隆并分别表达了CsLDH的两个表位E10-20和E94～102，重组表达蛋白可被CsLDH免疫血清识别，其中重组E94～102更易被识别，且该重组蛋白免疫血清能抑制CsLDH催化丙酮酸还原成乳酸的反应。此前，作者曾研究发现吡喹酮（Praziquantel）、阿苯达唑（Abendazole）、芬苯达唑（Fenbendazole）、甲苯咪唑（Mebendazole）等4种药物对CsLDH酶活性有明显抑制作用，亚细胞定位发现CsLDH是位于虫体皮层和消化道界面的膜蛋白，提示这些药物可能以CsLDH作为药物作用靶标[39]。

3 绦虫LDH

3.1 带绦虫LDH（TaeniaLDH）申萍香等[40]研究了亚洲牛带绦虫LDH（T. saginata asiatica, Ta）基因及其编码蛋白结构特性，发现该基因全长1285 bp，编码区为92～1084 bp，编码331个氨基酸，预测蛋白质的大小约为35 kDa，有3个跨膜区，没有其它亚细胞定位序列。戴佳琳等[41]发现牛带绦虫（T. saginata）成虫LDH基因的编码区有996 bp，编码的氨基酸有332个，理论分子量为35.4 kDa，Western-blot分析表明, 原核高效表达的重组蛋白具有较好的免疫原性。杜武英等[42-44]对猪带绦虫（T.solium）LDH基因进行了研究，发现存在猪带绦虫LDH A和B两个同源基因，全长分别为1332 bp（编码区为161～1153 bp）和1497 bp（编码区为166～1159 bp），均编码331个氨基酸；LDH A编码的蛋白质理论分子量约为35 kDa，含3个跨膜区和多个磷酸化位点，4个主要的B细胞抗原表位，且重组蛋白具有较好的免疫原性和免疫反应性；两种LDH在翻译后的修饰位点、3个跨膜区和其他线性表位方面不完全相似，但两者在蛋白的理化性质、L-LDH结构域、构成LDH酶催化中心的关键氨基酸、包含LDH活性位点的线性表位、无亚细胞定位等方面是一致的。研究还证实，两种LDH并非免疫诊断的特异抗原，但是膜定位发现，它们是重要的药物靶标和疫苗候选分子。陈祖云等[45]发现亚洲带绦虫的LDH在虫体表膜表达，功能受到抑制后，体内的丙酮酸不能有效的转化成乳酸排出体外，虫体内环境稳态遭到破坏，直接影响了虫体的表膜，这一点与吡喹酮作用后虫体表膜结构受到破坏的结果一致，该研究从分子水平证实吡喹酮对亚洲带绦虫LDH有明显抑制作用，其LDH可能是吡喹酮作用的分子靶标之一。方文等[46,47]用双向电泳结合免疫印迹技术分析了猪囊尾蚴（Cysticercus cellulosae）和牛囊尾蚴（C. bovis）LDH，结果表明，猪和牛囊尾蚴均能检测到LDH，其分子大小分别为35 368 Da和35 318 Da。

3.2 其他绦虫LDH吕刚等[48]用生物信息学识别欧猥迭宫绦虫（Spirometra erinaceieuropaei, Se）LDH全长cDNA序列，预测其编码蛋白的结构与功能，所获cDNA序列长1233 bp，最大编码序列为1016 bp，编码338个氨基酸残基，预测的分子量约为36 kDa，并推断LDH可能是是理想的免疫诊断、药物作用及疫苗靶分子。Gan等[49]研究细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus，Eg）LDH拓扑结构和功能，认为EgLDH是拥有2个跨膜区的合体跨膜蛋白，抗原决定簇抗体可以抑制EgLDH活性，试验表明EgLDH是抗Eg的潜在药物靶标和疫苗候选分子。

4 棘头虫LDH

许平等[50]研究发现蛭形巨吻棘头虫（Macracanthorhynchus hirudinaceus）LDH的活性与宿主猪的LDH存在差异，雄虫的LDH活性是雌虫的1.2倍，是宿主的1.6倍；雌虫的LDH活性是宿主的1.4倍，表明蛭形巨吻棘头虫LDH活力高于宿主的LDH活力。廖党金等[51]用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析蛭形巨吻棘头虫雄虫、雌虫体液和宿主血清的LDH同工酶的酶谱，结果表明雄虫有3条酶带、雌虫有2条酶带，具有很强的特异性；不同浓度的硝硫氰醚（Nitroscanate）对雄虫和雌虫特有的LDH同工酶酶带活性具有不同程度的抑制。

5 蜱螨LDH

李贵生等[52]用聚丙烯酰胺盘状电泳对格氏血厉螨（Haemolaelaps glasgowi）、鼠颚毛厉螨（Trieholaelaps myonyssognathus）和溜下盾螨（Hypoaspis lubrica）的LDH等同工酶进行了比较研究，分别获得了4、2、4条酶带，表明三个种属间存在差异。裘明华等[53]首次报道了三种硬蜱不同发育期的同工酶酶谱，其中长角血蜱（Haemaphysalis longicornis）雌虫和雄虫若虫LDH同工酶分别为2、3条酶带，而幼虫均为2条；亚洲璃眼蜱（Hyalomma asiaticume）雌虫和雄虫幼虫和卵中LDH均为2条酶带；残缘璃眼蜱（H. detritum）卵的LDH为2条酶带。

6 线虫LDH

Mannen等[54]研究发现秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans, Ce）LDH基因存在两个内含子，非脊椎动物LDH基因的两个内含子的位置相当于脊椎动物该基因的第二和第六内含子的位置，已有研究表明鸟类和哺乳动物中保守的LDH编码区存在6个内含子，CeLDH基因的编码区只包含其中的2个内含子。Tsoi等[55]分析秀丽隐杆线虫、哺乳动物、鸟类等物种的36种LDH同工酶的进化关系，表明哺乳动物LDH-C同工酶的出现似乎先于脊椎动物LDH-A和LDH-B的分化，后于非脊椎动物LDH。左迅等[56]对不同流行区周期型马来丝虫（Brugia malayi）微丝蚴同工酶进行圆盘电泳分析，结果显示7个地区LDH同工酶型没有任何差异，均为1条带，相对迁移率（Relativemobility, Rm）为0.358，出现率为100%。

综上所述，LDH是大多数体内寄生虫能量代谢中的关键酶之一，与寄生虫的生存密切相关。已有研究表明，各种寄生虫LDH在理化性质和分子结构方面有其独特性，可用于该种寄生虫病的快速诊断、治疗与监测、药物敏感性分析和药物筛选等。另外，吡喹酮、青蒿素及其衍生物、甲苯咪唑等药物均有广谱抗寄生虫功能，是目前广泛应用的抗寄生虫药物，但其作用机制不详。实验证明这些药物对寄生虫LDH均有抑制作用，提示LDH可能是潜在的药物分子靶标之一。因此，从分子水平对寄生虫LDH功能进行研究，将有助于进一步了解其在能量代谢中的作用、酶学及免疫学特性，对于促进寄生虫病诊断抗原和疫苗研究以及新抗虫药物的研发有重要的意义。

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PROGRESS IN RESEARCH ON LACTATE DEHYDROGENASE OF PARASITES

WANG Yan-ge, DONG Hui, HUANG Bing
(Key Laboratory of Animal Parasitology of Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The survival of most parasites mainly depends on the glycolytic pathway, in which glucose is metabolized to lactic acid for their energy generation. Lactate dehydrogenase (LDH) as a terminal enzyme on anaerobic glycolytic pathway catalyzes the reversible reaction of pyruvate reduction to lactate and lactate oxidation to pyruvate. Thus LDH is closely associated with parasitic survival. Previous studies have showed that LDHs from different parasites exhibit particular physicochemical properties and molecular structures and play as ideal potential targets for diagnosis and drug screening. Research on LDH functions would provide useful information on searching potential antigen candidates for diagnostics and vaccine and on screening therapeutic drugs for parasitic diseases.

Lactate dehydrogenase; parasites; diagnosis; drug target; vaccine

S852.724.2

A

1674-6422（2014）01-0080-07

2013-10-09

国家自然科学基金（31272557）

王艳歌,女，硕士研究生，预防兽医学专业

董辉，E-mail: donghui@shvri.ac.cn; 黄兵，E-mail: hb@shvri.ac.cn