应用Kappa检验比较猪蓝耳病ELISA抗体检测试剂盒

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（安徽省动物疫病预防与控制中心，安徽合肥 236001）

应用Kappa检验比较猪蓝耳病ELISA抗体检测试剂盒

刘 华，詹松鹤，何长生，朱良强

（安徽省动物疫病预防与控制中心，安徽合肥 236001）

[目的] 比较两个猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）抗体酶联免疫吸附试验（ ELISA）检测试剂盒结果的一致性。[方法] 对390份猪血清进行PRRSV抗体ELISA检测，应用Kappa检验比较两种试剂盒检测结果的一致性并进行分析。[结果] 两种试剂盒联合检测出250份PRRSV抗体阳性和70份阴性，阳性一致性为80.65%，阴性一致性为87.50%，符合率82.1%，结果一致性为中度一致（ Kappa 值=0.552） 。[结论]2种方法检测结果一致性较好，建议根据实际需要选择PRRSV抗体检测试剂盒。

猪繁殖与呼吸综合征；酶联免疫吸附试验试剂盒；比较；Kappa检验

猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起猪的一种接触性传染病。近年来，由于PRRS病毒基因变异，出现高致病性的病毒缺失变异毒株。已证实，它是引起我国南方地区“高热病”的主要病原之一。高致病性蓝耳病给我国养猪业造成了很大经济损失。从2009年起，农业部将其纳入强制免疫监测的动物疫病范畴。PRRSV抗体监测的方法较多，其中酶联免疫吸附试验（ELISA）为国际贸易中PRRSV抗体检测指定方法之一，能迅速检测大量样品，而且该方法具有敏感、特异、简便等特点。笔者用国内较广泛使用的两种进口猪蓝耳病病毒抗体ELISA检测试剂盒，检测了猪血清，并对两种试剂盒检测结果的一致性进行了分析，结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 猪血清

390份猪血清，为本实验室保存的春季集中检测样品。

1.2 检测试剂

猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒，分别为2个厂家生产，产品A（批号：09418-CE820）；产品B（批号：8D6B）。

1.3 检测方法

1.3.1 产品A

为N-ELISA，即测定病毒N蛋白。方法如下：血清用样品稀释液进行40倍稀释，浓缩洗液恢复到室温后混匀并用去离子水做10倍稀释。在试剂盒中96孔板的C1、C2、 D1、D 2中加入100μL未稀释的阴性对照，在A1、B1、A2、B2孔中加入100μL未稀释的阳性对照，被检样品各加两孔，每孔100μL 。室温孵育30 min，甩去液体，每孔用洗液300μL清洗3～5 次。每孔加入100μL酶标抗体，室温孵育30min。甩去液体，每孔用洗液300μL清洗3～5次。每孔加入100μL T MB底物溶液，室温孵育15 min。加入100μL终止液并读取OD650值。按试剂盒给定计算公式进行判定，S/P值≥0.4判为阳性。

1.3.2 产品B

为G-ELISA，即测定病毒G蛋白。方法如下：浓缩洗液恢复到室温后混匀并用去离子水做10倍稀释。浓缩的样品稀释液进行3倍稀释后，每孔加95μL至样品稀释板，加5μL待检血清，混合后室温静置5min。在96孔包被板A1、B1孔内加入50μL阴性对照，C1、D1孔中加入50μL阳性对照。将预稀释后的被检样品加入每孔，再加入45μL1×样品稀释液，37±2℃孵育1h，甩去液体，每孔用洗液300μL清洗3 次。每孔加入50μL酶标抗体，37±2℃孵育1h。甩去液体，每孔用洗液300μL清洗3次。每孔加入50μL底物溶液，室温暗室孵育10 min。加入50μL终止液混匀并读取OD450值。按试剂盒给定计算公式进行判定，IRPC值＞20判为阳性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计学软件对2 种产品检测的阳性率进行χ2检验；结果一致性进行Kappa 检验。Kappa系数<0，极差；0～ 0.2，微弱；0.21～0.4，弱；0.41～0.6，中度；0.61～0.8，高度；0.81～1.0，极强[1]。

2 结果与分析

产品A和B同时检测390份血清样本的结果比较见表1。

两种试剂盒联合检出250份阳性，阳性率64.10%。产品A单独检出260份阳性，阳性率66.67%。产品B单独检出310份阳性，阳性率79.49%，略高于产品A（χ2=16.29，p<0.01）。两个产品的阳性结果一致性为80.6%；阴性结果一致性为87.5%；总体样本结果的一致性为82.1%。根据Kappa一致性检验，Kappa值为0.553（95%置信区间：0.459-0.647），表明两种产品的一致性为中度一致。

3 讨论

3.1 Kappa一致性检验的应用

在检验医学研究工作中，常遇到评估两种检测方法、两名检验人员或两种设备检测结果的符合程度及用同一种方法进行多次测定的结果能否重现的问题[2]。国际上，主要依据美国临床实验室标准化协会（CLSI）EP12-2A文件公布的2种定性检测方法的一致性比较[3-4]。国内对兽用诊断制品的技术指标进行实验室检测主要参考农业部第 683 号公告有关规定进行，常采用对标准阳性血清和标准阴性血清进行检测，评价试剂盒的敏感性、特异性和符合率。其计算公式如下：敏感性= （与标准阳性血清检测结果一致的血清份数/标准阳性血清总份数） ×100%；特异性 = （与标准阴性血清检测结果一致的血清份数/标准阴性血清总份数）×100%；符合率 = （与标准血清检测结果一致的血清份数/标准血清总份数） ×100%[5]。笔者认为，兽医诊断试剂对Kappa一致性检验的应用，应加以重视和借鉴。

3.2 试剂盒选择

Kappa值主要体现两种不同试剂或方法检测结果的一致性，但不能判定哪个试剂盒或方法较好。Kappa值越大，两者一致性越高，则表明结果可靠程度越高[1]。可作为检测试剂或方法检测结果的可靠程度的参考。判定试剂盒的主要指标主要以对标准阳性血清和标准阴性血清进行检测，判定其敏感性和特异性。由于目前国内缺乏猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测的金标准，常无法做出判断。从本次试验的结果看，两种试剂盒的检测结果差异有统计学意义，结果中度一致，这与吴雪军等报道的基本一致[6]。因此，建议根据实际情况选择不同的试剂盒。

[1]Landis JR，Koch GG.The measurement of observer agreement for Gategorical data[J].Biometrics，1977，33：159-174.

[2]张波. Kappa一致性检验在流行病学中的应用举例[J].宁夏医学院学报，1995，17（4）：336-337.

[3]夏邦世，吴金华. Kappa一致性检验在检验医学研究中的应用[J]. 中华检验医学杂志，2006，29（1）：83-84.

[4]宋斌斌，赵瀛，张春燕，等.两种抗中性粒细胞胞浆抗体检测方法的结果比较[J]. 检验医学，2011，26（7）：457-460.

[5]吴华伟，高金源，邓永，等. 国内5种猪圆环病毒PCV2抗体检测试剂盒的比较试验[J]. 中国兽药杂志，2011，45（6）：11-12，15.

[6]吴雪军，周彩琴，赵灵燕，等. 检测猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒抗体的两种ELISA方法的比较及其应用[J].中国兽医杂志，2012，48（4）：27-29.

Application of Kappa Test for Evaluation of PRRSV Antibody ELISA Kits

Liu Hua，Zhan Songhe，He Changsheng，Zhu Liangqiang

（Anhui Center for Animal Disease Prevention and Control，Hefei，Anhui 230061 ）

Objective To compare the consistency between the results of the PRRSV antibody ELISA Kits produced by 2 frms. Method 390 swine serum samples were tested by the PRRSV antibody ELISA kits produced by two different frms. The consistency between the results of the 2 different kits was compared by means of Kappa test. Results 250 positive and 70 negative were tested by the 2 kits together．The positive consistency rate was 80.65%，and the negative consistency rate was 87.50%，and the coincidence rate was 82.1%. The consistency was moderate （Kappa=0.552）. Conclusion：The results showed a good consistency between the 2 kits，both could be used for PRRSV antibody detection，and it just depends on the actual needs.

porcine reproductive and respiratory syndrome；ELISA kit；comparison；Kappa test

S858.28

：B

：1005-944X（2014）11-0095-03

朱良强