三种猪病相关microRNAs的研究

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（1.北京出入境检验检疫局，北京 100026；2.中国动物卫生与流行病学中心，青岛 266032；）

三种猪病相关microRNAs的研究

柏亚铎1，尹羿1，郭敏卓1，刘凌1，王琳丽1，汪琳1，李卫华2

（1.北京出入境检验检疫局，北京 100026；2.中国动物卫生与流行病学中心，青岛 266032；）

本实验旨在探索繁殖与呼吸综合征（PRRS）、口蹄疫（FMD）和传染病胃肠炎（TGE）感染猪的microRNA （miRNA）变化，为疫病监测提供新途径。采用生物信息学方法预测可能的相关病毒miRNA，在MARC-145细胞系中转染10种miRNA mimic和inhibitor。相关实验结果发现过表达miR-125b、miR-147和miR-181降低了PRRSV的繁殖，而敲低miR-125b、miR-147和miR-181能促进PRRSV复制；感染猪口蹄病毒的样本中let-7a表达量明显上升，而miR-146b表达量明显下降；对照组中miR-142的表达量高于患有传染性胃肠炎样品。说明相关microRNAs可能参与病毒调控，可用作检测参考指标。

猪繁殖与呼吸综合征；猪口蹄疫；猪传染病胃肠炎；microRNA；生物信息学方法

病毒感染性疾病严重危害动物健康，是动物检疫工作的主要检测对象[1-2]。当前，猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）又称蓝耳病，是一种严重危害我国乃至全世界养猪业发展的猪免疫抑制性疾病，尤其是高致病性蓝耳病的爆发对我国养猪业造成了极大的损失[3]。猪口蹄疫（FMDV）是国际重点检疫对象，它是由口蹄疫病毒引起偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，表现为蹄冠、趾间、蹄踵皮肤发生水泡和烂斑，部分猪口腔黏膜和鼻盘也有同样病变[4]。猪传染病胃肠炎（TGE）是由猪传染病胃肠炎病毒引起的一种高度接触性消化道传染病，以呕吐、水样腹泻和脱水为特征[5-6]。

miRNAs是一类长度为19-24个核苷酸的非编码小分子RNA，在进化上具有高度保守性。miRNA通常以单拷贝、多拷贝或基因簇等形式存在于基因组中，首先编码基因转录出初级转录本，在Drosha酶和Dicer酶的作用下剪切成约22个核苷酸的成熟单链RNA。成熟的miRNA能够与靶标mRNA分子的3’末端非翻译区特异性结合，形成RNA沉默复合体并对靶标基因mRNA产生抑制性信号，使蛋白表达受到抑制，或直接导致mRNA的降解，参与转录后基因表达调控[7-10]。本实验旨在寻找猪体中发挥免疫作用的miRNA，为传染病检测探索新的方法。

1 材料和方法

1.1 细胞系、血清和细胞培养基

MARC-145细胞系、PK-15细胞系、胎牛血清购自HyClone；高糖DMEM购自Invitrogen公司。

1.2 主要试剂和仪器

细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；Takara Mini BEST DNA Fragment Purifcation Kit购自宝生物工程（大连）公司。

台式冷冻高速离心机（Eppendorf Centrifuge 5417R）；常规PCR 仪（GeneAmp PCR System 9700，ABI）；荧光PCR 检测仪（Roche 480、ABI 7500）。

1.3 miRNA和引物合成（表1，2）

人工合成miR-125、miR-24、miR-147、miR181、miR125b、let-7a、miR-146a、miR-146b、miR142、miR-155 mimic及其抑制物inhibitor，由上海吉玛制药技术有限公司合成，同时合成阴性对照miRNA control及相应抑制物inhibitor control。

表1 各种miRNA mimics和inhibitor序列

表2 Real-time PCR引物

1.4 生物信息学预测与FMDV、PRRSV、TGE 3’-UTR作用的潜在miRNA

生物信息学预测与FMDV、PRRSV、TGE-3’-UTR作用的潜在miRNA[11]，根据miRBase公布的miRNA，结合Mirnada，RNA hybrid和RNA22三个网络软件，预测FMDV、PRRSV、TGE 3’-UTR有潜在靶标的猪miRNA，选出可能性最大的miRNAs进行试验。

1.5 提取miRNA的优化

取50-100 mg组织（猪口蹄疫病毒收集脓疱液体，高致病性蓝耳病收集猪肺组织，传染性胃肠炎收集肠组织）放入1.5mL离心管，加入1mL Trizol混匀，加入氯仿，震荡混匀10-15s，室温放置2-3min，12000r/min 4℃离心15min，小心吸取上清透明液体500uL，移入一新离心管。加入等体积的异丙醇，使RNA析出沉淀。4℃离心，弃掉上清，加入1 mL 预冷的75%乙醇洗涤沉淀，温和震荡。4℃离心后小心弃去上清。待乙醇蒸发后取一定量（20-200uL）DEPC水，测量浓度及OD值。按组成配制反应液体系及反应条件（表3，4）。

表3 反转录反应体系

表4 反转录反应条件

1.6 Real-time PCR

实时荧光定量PCR采用7500 fast Realtime-PCR仪（ABI公司）对上述获得的cDNA进行检测。并优化PCR反应条件，发现普通RT-PCR在60℃3s，72℃ 11s，80℃ 3s有44个循环，miRNA RTPCR在95℃ 15s，60℃ 1min有40个循环。

表5 普通RT-PCR反应体系

表6 普通RT-PCR反应条件

表7 miRNA RT-PCR反应体系

表8 miRNA RT-PCR反应条件

2 结果

2.1 生物信息学预测与FMDV、PRRSV和TGE相关的miRNA

结合Mirnada、RNAhybrid和RNA22三个靶标预测软件，筛选到10条与潜在的猪miRNAs， miR-125、miR-24、miR-147、miR181、miR125b、let-7a、miR-146a、miR-146b、miR142、miR-155，由于他们的特异性，所以对其进一步筛选和检测。

2.2 miRNA在猪繁殖与呼吸综合征中的表达量差异

为了了解miRNA对PRRSV的影响，根据现有的研究挑选合适的miRNA，合成miR-125、miR-24、miR-147、miR181、miR125b、let-7a、miR-146a、miR-146b、miR142、miR-155 mimic和inhibitor。MARC-145细胞分别用mimic和inhibitor转染（浓度为30nM），12h后接着用PRRSV（WUH3株）感染细胞，在转染48h后，收集细胞检测病毒的繁殖。本研究通过噬斑实验发现过表达miR-125b、miR-147和miR-181降低了PRRSV的繁殖（图1A）；相反，敲低miR-125b、miR-147和miR-181能促进PRRSV复制（图1B）；其他的miRNA在MARC-145细胞中对病毒的繁殖没有明显的变化（图1A和图1B）。

图1 miR-125b、miR-147和miR-181对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制情况

之前数据显示噬斑实验发现过表达miR-125b、miR-147和miR-181降低了PRRSV的繁殖；相反，敲低miR-125b、miR-147和miR-181能促进PRRSV复制；其他的miRNA在MARC-145细胞中对病毒的繁殖没有明显的变化。这说明他们可能参与猪繁殖与呼吸综合征，所以进一步探索，本实验收集病猪与正常猪肺组织提取miRNA，发现miR-125b、miR-147和miR-181在感染病毒后表达量明显下降（图2），因此它们可能作为病毒病检测的指标。

图2 荧光定量检测猪繁殖与呼吸综合征中miRNA的表达量对比

2.3 miRNA在猪口蹄疫病毒中的表达量差异

图3 let-7a和miR-146b对口蹄疫病毒复制情况

人工合成miR-24、miR-147、miR181、miR125b、let-7a、miR-146a和miR-146b mimic和inhibitor。PK-15细胞分别用mimic和inhibitor转染（浓度为30nM），12h后接着用FMDV（Asia1江苏株）感染细胞，在转染48h后，收集细胞检测病毒繁殖情况。本研究通过噬斑实验发现过表达let-7b降低了FMDV的繁殖，过表达miR-146b增加了病毒繁殖（图3A），相反，敲低let-7b能促进FMDV复制，敲低miR-146b降低了病毒繁殖（图3B），其他的miRNA在PK-15细胞中对病毒的繁殖没有明显的变化（图3A和图3B）。

用real-time PCR检测感染口蹄疫病毒的猪的脓疱中提取的miRNA，根据以前相关的报道以及前期试验，筛选出let-7a和miR-146b，本研究对比健康组织和感染口蹄疫病毒（FMDV）猪的样本，通过real-time PCR检测发现感染病毒的样本中let-7a表达量明显上升，而miR-146b表达量明显下降（图4）。这就说明let-7a和miR-146b参与了对口蹄疫病毒的调控。

图4 荧光定量检测猪口蹄疫病毒中miRNA的表达量对比

2.4 猪传染性胃肠炎检测miRNA的表达量差异

针对这10种miRNA，本实验主要挑选与它同源相似性高的miR-142进行检测，从组织中提取RNA，然后real-time PCR检测miR-142的表达量，发现对照组中miR-142的表达量高于患有传染性胃肠炎样品（图5）。所以miR-142也可能作为一个检测miRNA来判定是否患有传染性胃肠炎。

3 讨论

现有大量研究证明，细胞中miRNA可以对病毒起到调节作用[12-14]。所以miRNA与猪口蹄疫、猪繁殖与呼吸综合征以及猪传染性胃肠炎的研究有助于为病毒防控带来新的机遇[15-16]。

图5 荧光定量检测传染性胃肠炎中miR-142的表达差异

本实验通过生物信息学预测了10条猪的miRNAs进行验证，其数据发现了在MARC-145细胞系中转染miR-125、miR-24、miR-147、miR181、miR125b、let-7a、miR-146a、miR-146b、miR142、miR-155 mimic和inhibitor，结果显示过表达miR-125b、miR-147和miR-181降低了PRRSV的繁殖，而敲低miR-125b、miR-147和miR-181能促进PRRSV复制。其他miRNA在MARC-145细胞中对病毒的繁殖没有明显的变化，说明这三种miRNA对猪繁殖与呼吸综合征起调节作用。根据之前的一些报道，本实验收集了患有猪口蹄疫、猪繁殖与呼吸综合征以及猪传染性胃肠炎的样本，在患有猪口蹄疫病毒中检测到let-7a表达量明显高于对照组，然而miR-146b表达量却明显低于对照组，结果显示了let-7a和miR-146b参与了猪口蹄疫病毒的调控。同时将正常肺组织对比了患有猪繁殖与呼吸综合征的肺组织，发现miR-125b、miR-147和miR-181在感染病毒后表达量明显下降，这与体外细胞实验结果一致，因此可作为该病检测的一个靶点。根据生物学预测的miRNA，本实验检测了miR-142在传染性胃肠炎样本中表达情况，发现它稍微低于对照组，说明它也可能参与其表达。

miRNA与猪口蹄疫、猪繁殖与呼吸综合征以及猪传染性胃肠炎的研究不仅能检测出进口活猪潜在携带的所有病毒种类，定期对来自不同国家的猪进行大规模疫病筛查，了解世界各国猪疫病流行情况，并在出现动物死亡时，可以快速、准确地筛查出死亡猪体内可能存在的病毒，为判断死因提供依据。

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A Preliminary Study of microRNAs Associated with Three Swine Diseases

Bai Yaduo1，Yin Yi1，Guo Minzhuo1，Liu Ling1，Wang Linli1，Wang Lin1，Li Weihua2

（1. Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026；
2. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

Abstrct：The study was aimed to explore the pig microRNA（miRNA）associated with porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV），foot and mouth disease virus（FMDV）of pig and transmissible gastroenteritis virus （TGEV）infections in order to explore new means for disease detection. At first，the virusassociated miRNAs were predicted by bioinformatics method. Then，MARC-145 cells were transfected with the mimic or inhibitor of various miRNAs，and the related experiments showed that over expression of miR-125b，miR-147 and miR-181 could inhibit PRRSV replication and their knockdown could promote virus replication；the let-7a expression was increased signif cantly while the miR-146b expression decreased signif cantly in FMD-infected pig samples；and the miR-142 expression in the control group was higher than in the TGE-infected samples，suggesting that associatedmiRNAs were possibly involved in virus modulation and could be used as disease indicators.

porcine reproductive and respiratory syndrome；foot and mouth disease；transmissible gastroenteritis；microRNA；bioinformatics method

S858.28

：A

：1005-944X（2014）11-0090-05

国家质检总局科技计划项目（2013IK027）资助

柏亚铎