2013年国内外蜂产品质量安全研究进展（续）

周金慧 郭伟华 李熠 吴黎明 薛晓锋 张金振 陈芳 陈兰珍 王鹏 黄京平 金玥 赵静

（中国农业科学院蜜蜂研究所，农业部蜂产品质量监督检验测试中心，北京100093）

2013年国内外蜂产品质量安全研究进展（续）

周金慧 郭伟华 李熠 吴黎明 薛晓锋 张金振 陈芳 陈兰珍 王鹏 黄京平 金玥 赵静

（中国农业科学院蜜蜂研究所，农业部蜂产品质量监督检验测试中心，北京100093）

（续2014年第3期上半月）

拉曼光谱是一种散射光谱，其原理是对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息，并应用于分子结构研究的一种分析方法。最常用的红外及拉曼光谱区域波长是2.5～25μm。通过拉曼光谱，化学计量学方法和人工神经网络快速分析蜂蜜中糖类，包括葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖含量[11]。由于糖分子在蜂蜜样品中的相似性，使得仅运用单一的方法来测定蜂蜜中的糖类是不可能的。这个瓶颈通过结合拉曼光谱，化学计量学方法（主成分分析和偏最小二乘回归法(PLS)）和人工神经网络方法(ANN)得到解决。四类糖的模型分析用主成分分析观察到有明显的分离。这个方法通过最小偏二乘回归得到了光谱特征，能够对蜂蜜中糖类进行判别分析。模型/训练网络用校准数据集创造，用校验数据集评价。葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖的实际值和预测值的PLS相关系数分别是0.964,0.965,0.968和0.949，ANN分析的相关系数是0.965,0.965,0.978和0.956，该方法能够快速分析市场蜂蜜中的糖类含量。

同位素分析是溯源分析研究中常用的一种重要工具。蜂蜜的掺假方式多种多样，比较常见的是在蜂蜜加工过程中加入不同的糖浆。通过加入高果糖浆、葡萄糖浆和蔗糖糖浆（甜菜糖）的质量比分别为0%、10%、20%、40%和50%来制作掺假蜂蜜。运用C-13/C-12同位素比率分析方法结合同位素质谱和元素分析仪(EA-IRMS)分析产自于甜菜或甘蔗的淀粉糖浆，高果糖浆，葡萄糖浆和蔗糖糖浆。用C-4糖浆（高果糖浆，葡萄糖浆）掺假的蜂蜜在一定程度上能够被检出，C-3（甜菜糖）糖浆掺假的则不能被检出。蔗糖糖浆（甜菜糖）掺假的蜂蜜仍存在严重的检测问题，特别是在一些甜菜用来生产糖的国家[12]。在利用同位素比率质谱技术对蜂蜜掺假的鉴别研究中，通过对3种糖浆、3种掺糖蜜和纯正蜂蜜测定结果和图谱的多重比较，发现单纯的使用元素分析联用同位素比率质谱(HT-IRMS)进行测定，无法完全鉴别出掺糖蜜，但是结合LC-IRMS的测定结果则能有效的对以上3种方式的掺假进行鉴别。对6种特制蜂蜜进行测定并判定，判定结论与实际制样情况相符[13]。Messia,M.C.等[14]利用液相色谱分析来自于中国和意大利的蜂王浆中糠氨酸和癸烯酸含量，进而确定蜂王浆的新鲜度和真实性。此外，还利用高分辨魔角旋转核磁共振光谱(HR-MAS NMR)分析蜂王浆样品的水溶性物质，包括氨基酸、糖和脂肪酸等物质。液相色谱和核磁共振光谱联用通过主成分分析寻找来自于中国和意大利的样品的特征物，并且区分这些样品。

蜂胶的溯源分析在近些年一直是研究的热点，包括国内不同产地的蜂胶以及中国蜂胶与外国蜂胶之间的差别研究。蜂胶的质量主要由植物源和蜜蜂的种类决定的。利用孢粉学和理化参数对来自于巴西东北、东南和南部的21份蜂胶样品进行分析。研究结果显示，来自于不同地域的来自于菊科植物的蜂胶中阿特匹林-C的浓度差异较大[15]。

2.3金属元素分析

矿物金属是蜂蜜中本身所含有的以原子状态存在的对人体有益的元素，而游离的重金属是外界混入的以原子状态存在的对人体有害的元素。蜂蜜中游离的重金属，是呈酸性的蜂蜜在采集、包装、加工和储存过程中直接接触了铅、锌、铁等重金属而被腐蚀污染所致。金属元素及其形态主要利用原子荧光、原子吸收、电感耦合等离子体-质谱联用等方法进行分析。采用多变量分析技术分析来自波兰和欧洲的不同地方以及不同植物源的66个蜂蜜样品中的14种元素 (Ca,Mg,K, Na,P,Co,Mn,Fe,Cr,Ni,Zn,Cu,Cd和Pb)。采用火焰原子吸收光谱法，用硝酸和自动微波消解系统湿法消解和氘灯背景扣除校正来检测总金属含量。磷以钼磷酸盐的形式采用光谱光度测量法进行测定。通过分析定值标准物质茶(NCS DC 73351)和卷心菜(IAEA-359)来检验方法的可靠性，分析数据表明了这些蜂蜜的质量较好，特别是有毒微量元素如镉和铅的浓度很低。将实验数据进行多变量分析，包括如因子和聚类分析方法来评估数据模型并根据矿物质含量将不同蜜源植物的蜂蜜进行分类。九个金属元素可作为描述每一个样品的化学特征物质。此外，结果也显示蜂蜜在不同的植物源、地理来源、加工过程中的元素组成有显著差异[16]。

Ru,Q.M.等[17]采集浙江省8种不同种类的蜂蜜测定其铜、锌、镉、铅、砷、汞含量并进行重金属风险评估。结果显示，六种重金属含量的值均低于GB2762-2005和GB14963-2011中规定的食物和蜂蜜中最大允许限量。单个重金属的危害商数和六种重金属的总危害指数均很低，表明了在目前浙江的蜂蜜消费水平，消费者是没有重金属慢性毒性的风险。但是砷的致癌风险对于浙江女性消费者超过了可接受水平10-4。因此，蜂蜜中砷含量是最值得关注的。波兰南部 Malopolska Voivodeship不同地方蜂场的多花蜜、王浆、花粉和蜂蜡中的镉、镍、铅、铁、镁、锌含量[18]结果显示，蜂蜜中所有被测的金属含量都很低，其中镉和铅的浓度均低于允许水平，而其他蜂产品中含有较高浓度的镉和铅。来自于特定区域的王浆和花粉明显被铅污染，蜂蜡中也含有较高的金属含量。蜂蜡中的下列金属间的含量呈正相关：镉-镍，镉-铁，镍-铁，镍-镁，铅-铁，铁-镁。值得关注的是，蜂蜜和蜂蜡中Fe含量以及蜂花粉和蜂胶中Mg的含量不呈正相关。结果表明，蜂产品的金属含量变化有助于监控环境污染情况。

浊点萃取法(cloud point extraction，CPE)是近年来出现的一种新兴的液-液萃取技术，不使用挥发性有机溶剂，不影响环境。它以中性表面活性剂胶束水溶液的溶解性和浊点现象为基础，改变实验参数引发相分离，将疏水性物质与亲水性物质分离。目前该法已成功地应用于金属螯合物、生物大分子的分离与纯化及环境样品的前处理中。以8-羟基喹啉为络合剂，非离子表面活性剂TritonX-100为萃取剂的浊点萃取-火焰原子吸收法(CPE-FAAS)可用于测定蜂蜜中的金属元素，如痕量的锰等[19]，并研究了pH值，平衡时间，离子强度，萃取剂用量以及络合剂用量和共存离子干扰等对萃取效果的影响。方法线性范围为100～700 ng/mL，检出限为5.74 ng/mL，相对标准偏差为1.68%(n=11)，回收率为97.3～98.6%。

2.4活性组分分析

蜂蜜中的活性组分主要包括糖类物质、维生素、氨基酸和酚酸类物质等，这些内源性活性物质主要是利用液相色谱配备不同的检测器进行分析。利用二极管阵列-高效液相色谱法测定土耳其蜜露蜂蜜和花蜜蜂蜜中的多酚类物质并且比较了土耳其蜜露和花蜜中的酚类化合物[20]。利用二极管阵列-高效液相色谱法定性和定量20种酚类化合物，在蜜露蜂蜜中未检出松属素和槲皮素，但在花蜜蜂蜜中发现了此类黄酮物质的存在。蜜露中主要是儿茶酸，花蜜中主要是绿原酸。另外，在花蜜蜂蜜中的酚类化合物中也发现了统计学上的显著相关性，如咖啡酸和绿原酸(r=0.908)，绿原酸和对香豆酸(r=0.836)，咖啡酸和对香豆酸(r=0.893)。这些蜂蜜中的酚类物质可能为判定不同植物来源的蜂蜜提供了标志物。通过对蜂蜜成分的分析和研究，发现蜂蜜所含的一种名为酚醛树脂(phenolics)的化合物，具有抗氧化的特性。这种物质能清除自由基分子，那是人体正常代谢过程中产生的一种不稳定物质，对血管有破坏作用，同时还会引起DNA的突变，导致癌症的发生。研究人员利用超高效液相色谱 (UHPLC)结合线性离子阱(LTQ)、轨道阱质量分析仪和混和质谱分析塞尔维亚单花蜂蜜中的酚醛[21]。蜂蜜样品来自于不同植物源：刺槐，向日葵，椴树，罗勒，荞麦，油菜，麒麟草。分析的43种化合物主要是黄酮类化合物，通过特征性质谱和裂解规律已证实黄酮类化合物在所有蜂蜜中均存在。在所有蜂蜜提取液中均发现高含量的白杨素，松属素，高良姜素，但香豆酸在罗勒，荞麦和麒麟草蜂蜜中未检出，在向日葵蜂蜜中发现另一个更高含量的黄酮类化合物没食子酸（最大含量为1.45mg/kg）。和其他蜂蜜相比，荞麦蜜的芹菜素更高。用模式识别技术和主成分分析方法可对蜂蜜样品的种类进行分类。实验表明，线性离子阱轨道阱方法在基于分子质谱和碎片裂解规律准确地检测酚酸及其衍生物和黄酮苷配基上是可靠的。利用二阶矫正法建立的HPLC-DAD方法也可定量分析五种蜂蜜中九种多酚类物质[22]。样品处理步骤相比于传统处理是简单有效的。基线漂移通过克服附加因素和分析物在数学模型中的漂移实现。由交替三线性分解算法获得的多酚类含量可以用于区分蜂蜜的蜜源植物种类。方法呈现良好的线性(r＞0.99)，分析速度 (t＜7.60 min)和准确度，因此，该方法定性和定量复杂基质中的多酚类物质。

蜂蜜中维生素分析面临的问题是由于研究的维生素种类较多，所以很难在较短的时间内达到较好的分离度。V León-Ruiz等[23]利用等强度洗脱的反相液相色谱定性和定量蜂蜜中水溶性维生素。经过测试的流动相为水溶性硫酸溶液，紫外和荧光检测器同时检测。维生素C，B1，B3N，B3H，B5，B6在15min内获得。向流动相重加入甲醇2%可以显著的降低分析时间，将维生素的总分离时间降到了10min内，在由于流动相中阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)可使维生素C,B1，B3N，B3H和B2在6min内就能完全分离。

氨基酸的分析主要是利用氨基酸分析仪或液相色谱分析。周贤婧等采用毛细管电泳-间接紫外检测法同时分离测定蜂蜜中的赖氨酸、色氨酸、谷氨酸等9种氨基酸[24]。考察了磷酸浓度、进样方式和缓冲液pH对分离效率和重现性的影响。在分离电压为-15 kV、检测波长为220 nm条件下，以含有0.5 mmol/L十六烷基三甲基溴化铵、20 mmol/L烟酸、10%甲醇的10 mmol/L磷酸二氢钠缓冲溶液 (pH＝10.2)为运行缓冲液，9种组分在11 min内达到基线分离；检出限最低可达到0.3 mg/L；线性范围为1.0～1000 mg/L；日间及日内精密度为0.64～5.83%。实际样品中除甲硫氨酸外的8种氨基酸的加标回收率为60.00～118.37%。将该方法应用于不同蜜源植物和产地的蜂蜜样品的测定，在市售的5种蜂蜜中均检测到脯氨酸、丝氨酸和天冬氨酸，而只在荔枝蜜中检测到苏氨酸。该方法可以为蜂蜜的蜜源鉴别及质量评估提供借鉴方法。S Akamatsu等[25]利用毛细管电泳-串联质谱技术分析蜂王浆中的16种氨基酸含量，样品前处理过程无需浓缩和衍生化步骤。以未涂层融硅石英毛细管为分离柱，并含有1M的甲酸溶液作为电解液混合含有50%甲醇的鞘流液，然后用串联质谱检测。该方法可以用来区分不同种类的蜂王浆产品。

3 总结

2013年已经出版的与蜂产品质量安全相关的文献中与蜂蜜和蜂胶相关的研究较多。利用简单，快速和更加新颖的样品前处理方法分析蜂产品中的农药和兽药残留，其中QuEChERS方法已经广泛的应用于实际的检测中，但是固相微萃取、液相微萃取、分子印迹等技术还仅限于研究领域。重金属的研究主要涉及常量和痕量元素的同时分析，并且用于蜂产品的植物源和地理源的鉴别，甚至还会用于监控环境的污染情况。活性组分的研究侧重于酚酸类化合物、氨基酸、糖类物质和维生素含量的分析。溯源分析利用的分析方法较多，包括液相色谱、气相色谱及其与不同检测器联用，色谱之间的二维联用方法，然后对获取的数据进行分析，寻找特征物，结合化学计量学进行主成分、偏最小二乘法、软独立建模分类法和人工神经网络等模式识别分析方法鉴别蜂产品尤其是蜂蜜和蜂胶的植物源和产地。

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